线粒体乙醛脱氢酶2在糖尿病心肌病中的保护作用及可能机制探讨

摘要

目的：研究线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）在糖尿病大鼠离体心肌损伤中的作用，进一步探讨ALDH2的心肌保护作用是否与减少体内氧化应激及心肌纤维化、抑制凋亡发生及增加线粒体融合蛋白2（Mfn2）表达有关。
　　方法：腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型，DM组大鼠空腹12h后腹腔注射STZ55mg/kg，随机分为DM4w组，8w组，12w组，每组8只。另取DM大鼠8只，于造模成功后的第2周将饮水换成2.5℅的乙醇，第3周后换成5℅的乙醇，持续给药至8周为EtOH+DM8w组。造模成功后分别于4w、8w、12w行离体心脏灌流，测定心室动力学指标和心肌组织超氧化物岐化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）和羟脯氨酸（Hp）含量变化；光镜和电镜观察心肌组织结构的变化；RT-PCR、Real-Time PCR测定左心室前壁心尖组织线粒体ALDH2和Mfn2 mRNA的表达， Western blot检测ALDH2蛋白表达，免疫组化检测Mfn2蛋白表达；分光光度法测定心肌 Caspase-3和 Caspase-9活性。
　　结果：⑴左室心功能指标：与同时间段Control组相比，DM4w组左室发展压（left ventricular developed pressure, LVDP）、左室内压最大上升/下降速率（maximal rise/fall rate of left ventricular pressure,± dp/dtmax）无明显变化；DM8w、DM12w组LVDP、±dp/dtmax均降低。与DM8w组相比，EtOH+DM8w组LVDP和±dp/dtmax均抬高。⑵抗氧化应激：与同时间段Control组相比，DM4w组心肌SOD活性降低，MDA含量增高；DM8w、DM12w组心肌SOD活性明显降低，MDA含量明显增高；且随着病程的延长，SOD活性降低明显，MDA含量增高显著。与DM8w组相比，EtOH+DM8w组心肌SOD活性升高，MDA含量降低。⑶心肌胶原：与同时间段Control组相比，DM4w组心肌羟脯氨酸含量增高；DM8w、DM12w组羟脯氨酸含量明显增高；且随着病程的延长，羟脯氨酸的含量显著增高。与DM8w组相比，EtOH+DM8w组心肌组织中羟脯氨酸含量降低。⑷镜下指标：光镜和电镜结果显示，与同时间段Control组相比，DM4w组心肌结构无明显改变；DM8w组心肌纤维排列紊乱，心肌间隙增宽，部分线粒体基质及嵴肿胀；DM12w组心肌纤维断裂、溶解，线粒体肿胀变性、嵴消失。与DM8w组相比，EtOH+DM8w组心肌病变减轻。⑸基因表达：RT-PCR和Real-Time PCR结果显示，与同时间段Control组相比，DM4w、DM8w、DM12w组心肌ALDH2和Mfn2 mRNA表达均降低；且随着病程的延长，ALDH2和Mfn2 mRNA表达进一步降低。与DM8w组相比，EtOH+DM8w组心肌ALDH2和Mfn2 mRNA表达升高。⑹蛋白表达：免疫组化结果：与Control组相比，DM4w、DM8w、DM12w组心肌Mfn2蛋白表达降低；与DM8w组相比，EtOH+DM8w组心肌Mfn2蛋白表达上升。Western blot结果：与同时间段Control组比较，DM8w组心肌ALDH2蛋白表达降低；与DM8w组相比，EtOH+DM8w组心肌ALDH2蛋白表达上升。⑺凋亡指标：与DM8w相比，EtOH+DM8w组Caspase-3，Caspase-9的含量降低。
　　结论：ALDH2在糖尿病大鼠心肌组织中呈低表达，且随病程进展， ALDH2的表达逐渐降低，心肌氧化应激损伤和纤维化加重，促进心肌凋亡的发生。激动ALDH2在糖尿病大鼠心肌中的表达发挥保护作用，其机制可能与提高心肌Mfn2表达、减轻氧化应激和心肌纤维、抑制凋亡的发生有关。

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前言

材 料 与 方 法

1.动物

2.药品与试剂

3.特种气体

4.主要仪器与设备

5.动物模型建立与分组

6．左心室功能评价

7．心肌标本的制备

8．心肌胶原、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的测定

9．HE染色行光学显微镜观察

10．电子显微镜观察

11．RT-PCR和Real-time PCR检测线粒体ALDH2和Mfn2基因表达

12．免疫组化（IHC）法观察Mfn2蛋白的表达

13 Western blot观察ALDH2蛋白的表达

14 统计学处理

结果

1．各组大鼠一般情况

2．大鼠体重，心脏重及心体比的改变

3．左心室功能的变化

4．生化指标改变

5．光镜下大鼠心肌形态学观察

6．电子显微镜下心肌超微结构的变化

7．RT-PCR和Real-time PCR 监测大鼠心肌组织ALDH2和Mfn2 mRNA的表达

8﹒大鼠心肌中Mfn2蛋白的表达（免疫组化结果）

9﹒大鼠心肌中ALDH2蛋白的表达（Western blot结果)

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A中英文词汇及缩写对照表

附录B个人简历

附录C 综述: 线粒体融合蛋白2在心血管系统中的作用