按人造血发育程序诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

摘要

胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)是具有自我更新和向机体三个胚层各种细胞分化潜能的原始细胞。自动物胚胎干细胞建系以来，定向造血分化就成为研究的热点。1998年人类胚胎干细胞建系以后，在定向造血研究领域更加活跃。生物技术角度看，在将来有望可采用治疗性克隆技术实现临床恶性血液病(白血病、淋巴瘤等)、遗传病(地中海贫血)和再生障碍性贫血等血液系统疾病的细胞替代治疗。如能实现体外规模化大量生产造血干/祖细胞，则可最终解决临床移植中供体来源不足的难题。 本研究主要内容分为以下几个部分：1BMP4、VEGF促进小鼠E14胚胎干细胞发育为富含造血前体细胞的拟胚体(embryoidbody,EB)(stepⅠ) 2不同造血位点基质细胞共培养体系促进拟胚体源性细胞进一步分化为造血干细胞2.1人胚发育早期AGM区基质细胞促进拟胚体细胞造血分化发育(StepⅡ)2.2人胚孕中期胎肝基质细胞促进上述AGM诱导后细胞群向造血分化发育(StepⅢ)2.3人骨髓基质细胞进一步促进stepⅢ细胞进一步向造血分化(StepⅣ) 3各组定向诱导条件下获得造血干细胞的致瘤性检测和成体动物造血重建实验第一部分BMP4、VEGF对ESC向拟胚体发育过程中造血前体细胞的诱导作用1研究方法将小鼠E14胚胎干细胞维持生长于底层铺有小鼠胚胎成纤维细胞(murineembryonicfibroblast，MEF)饲养层的6孔细胞培养板中，每2～3天传代培养，可保持良好的未分化状态。 第二部分按胚胎发育时空顺序诱导EB细胞向造血干细胞发育分化ESC已经在体外可被定向诱导为多种类型细胞，但已有造血定向分化的研究资料均显示诱导效率不高，且分化时相控制较难，往往易得到分化终末期的细胞，如成熟的红系、粒系及T、B淋巴细胞等，较难得到处于分化早期、能够重建造血的HSC。因此，如何控制分化的时相，诱导、扩增出大量处于分化早期的HSC，是目前ESC造血分化研究的重点。根据造血发生发育生物学知识，早期各造血位点的微环境对原始造血前体细胞向造血方向分化具有重要的调节作用。这些造血微环境理论上对同样处于原始分化状态的ESC定向诱导造血也有类似的调节作用。本研究拟按照造血发生发育的时空顺序，先将小鼠E14细胞诱导发育为EB。再依次在人胚胎早期确定造血的各发生发育位点，即AGM区基质细胞、胎肝造血期基质细胞、骨髓基质细胞共培养条件下，逐步观察ESC向造血干细胞分化发育情况，分别检测造血干细胞的比例和造血功能。期望进一步诱导分化中获得更高效、高产率的HSC，为研究ESC分化为HSC的分子机制提供实验模型，并寻求优化体外ESC定向造血干细胞分化的诱导条件。 第三部分不同诱导体系(阶段)的ESC来源HSC成体动物体内造血重建实验为了检验本研究上述不同诱导体系条件下获得的各阶段造血干细胞的体内造血功能，进一步将这些造血干细胞接种于放射致死剂量照射的成年雌性Balb/c小鼠，观察受体小鼠的存活率、造血恢复情况及供体细胞植入能力。以此动物实验进一步判断各分化发育阶段的造血干细胞的体内造血重建能力和安全性。

目录

论文说明：英文缩写词表

引言

第一部分BMP4与VEGF促进EB发生原始造血前体细胞的作用

第二部分含AGM、FL、BM基质细胞培养体系程序化诱导EB细胞向HSC分化的作用

第三部分不同诱导阶段的ESCS体内造血重建实验

全文总结

附图

参考文献

致谢

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