果蝇box C/D snoRNA鉴定和内含子保守序列的系统分析

摘要

非编码RNA(ncRNA)是一类功能广泛的RNA分子，它们以结构、催化或调控分子的方式参与细胞中的各种生命活动。大规模筛选和鉴定ncRNA，从而研究其结构和功能，对揭示细胞中的各种生命现象具有重要作用。 本文采用计算机RNA组学方法对黑腹果蝇(D.melanogaster)核仁小分子RNA(snoRNA)进行了全基因组水平的搜索分析，初步获得了来源于内含子区域的159种候选分子。再通过文库构建和Northern杂交方法的证实，鉴定了31种新的box C／D snoRNA。对31种新的box C／D snoRNA的功能进行了预测，其中25种可以指导修饰靶RNA分子(rRNA和snRNA)的甲基化修饰，另外6种由于未找到与rRNA和snRNA配对的功能区暂时被命名未“孤儿”分子(orphansnoRNA)。研究发现，果蝇box C／D snoRNA在内含子中具有非常明显的位置效应，其加工模式与其在内含子中的位置相关，绝大部分box C／D snoRNA为内含子加工依赖型。通过对所有box C／D snoRNA组织形式的分析，除了已报道的2个dUHG，本文又发现了6个新的dUHG。果蝇所有dUHG中的snoRNA分子数达51个，占已鉴定snoRNA分子总数的49％，表明果蝇中dUHG模式是一种占主导的基因组织形式。本文以六个果蝇近缘种的duHG同源区域为主要对象，对snoRNA分子的发生和进化进行了研究，表明dUHG中snoRNA的演化可能具有两种模式，即基因重复和基因转座。并推测dUHG中的snoRNA通过重复产生冗余拷贝，不断积累突变而与原基因产生分化，从而形成具有新功能的非编码RNA。 结合上述31种新的box C／D snoRNA和果蝇中所有已报道的非编码RNA，本文发现100-500bp长度范围的内含子是包含小分子非编码RNA的重要区域。对snoRNA侧翼的保守序列的分析，发现了在同一个内含子中与snoRNA共转录的新的非编码RNA，表明内含子中还隐含着新的非编码RNA，为在内含子中继续鉴定新的非编码RNA提供了初步线索。本文利用比较基因组学的方法对黑腹果蝇与其近缘种的基因组中的序列，主要针对小于500bp的内含子序列，进行了保守性分析，并获取了大量的保守序列(Multi-species Conserved IntronicSequences．MCISs)。通过对内含子大小区间分段分析，发现绝大部分minimalintron或小于100bp的内含子并不保守，只有0.2％的含有保守序列，表明这类内含子基本不含有功能序列。相反，研究发现100-500bp区间的内含子含有大量的保守序列。对文中的396 MCISs数据库中部分保守序列设计探针检测其作用为RNA基因的可能性，结果成功地鉴定了5个新的非编码RNA，包括2种miRNA、1种snoRNA、2种功能未知的新非编码RNA，进一步说明保守序列可能为未知的非编码RNA区域。但是，杂交鉴定的结果表明只有5％的保守序列可以加工成稳定表达的小分子RNA。加上396 MCISs数据库中保守序列对应的已知的38个非编码RNA，这些具有稳定RNA产物的反式因子的比例也只有11％左右，说明大部分的内含子保守序列可能作用为顺式元件。进一步分析保守序列的宿主基因的转录，发现大部分保守序列的宿主基因只有一个转录本，说明这些保守序列与选择性剪接无关，推测可能参与了宿主基因的表达调控、辅助染色质的结构形成等其它作用。 本研究取得的成果为全面了解果蝇基因组中ncRNA的种类，结构和功能奠定了基础，同时为在内含子中大规模地研究和鉴定新的顺式元件和反式作用因子，以及研究内含子在进化上的意义提供了重要参考。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

1.1 非编码RNA的研究进展

1.2 非编码RAN的研究方法

1.3 核仁小分子RNA(snoRAN)简介

1.3.1 snoRAN的研究历史

1.3.2 snoRAN的结构与分类

1.3.3 snoRAN的基因组织与表达

1.3.4 snoRAN的生物学功能

1.4 微小分子RAN(miRAN)简介

1.4.1 miRNA的研究历史

1.4.2 miRAN的基因组织结构与特点

1.4.3 miRAN的转录和加工成熟

1.4.4 miRAN的作用机制

1.4.5 miRAN的生物学功能

1.5 内含子中功能序列的研究进展

1.6 本研究的目的和意义

第2章材料和方法

2.1 数据库及软件

2.1.1 基因组数据、基因数据及注释

2.1.2 相关的在线软件或软件包

2.2 实验材料

2.2.1 果蝇的介绍

2.2.2 果蝇的培养

2.2.3 酶和试剂

2.2.4 寡聚核苷酸引物

2.2.5 细菌菌株

2.2.6 培养基

2.2.7 克隆载体

2.2.8 主要缓冲液和试剂的成分及配制

2.3 实验方法

2.3.1 果蝇总RNA的制备

2.3.2 果蝇小分子量RNA的分离

2.3.3 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA

2.3.4 探针制备，标记与纯化

2.3.5 cDNA文库的构建

2.3.6 cDNA文库的筛选

2.3.7 Northern杂交

2.3.8 Reverse Transcription分析

第3章 果蝇box C/D snoRNAs基因的大规模分析和鉴定

3.1 计算机RNA组学法对果蝇box C/D snoRNA基因的大规模筛选

3.3.1 snoScan程序的参数调试及运算

3.1.2 候选分子的筛选及分析

3.1.3 组织形式和保守修饰位点的分析对候选分子数据的补充

3.1.4 对候选分子在内含子中的位置分析

3.2 利用实验RNA组学对候选分子的验证

3.2.1 box C/D snoRNA文库的构建

3.2.2 box C/D snoRNA文库鉴定了12 种新的SnoRNA

3.2.3 Northern 杂交鉴定了19种新的snoRNA

3.3 果蝇全基因组的snoRNA基因的统计分析

3.4 果蝇snoRAN基因组织的进化

3.4.1 dUHG中snoRAN基因的发生

3.4.2 dUHG中snoRNA基因的功能演化

3.5 讨论

3.5.1 计算机RNA组学是大规模筛选snmRNA的非常有效的方法

3.5.2 果蝇snoRAN基因组织形式的特点

3.5.3 果蝇box C/D snoRNA基因的加工模式

3.5.4 果蝇已有的box C/D snoRAN指导修饰位点的分析

3.5.5 果蝇snoRNA基因进化的探讨

第4章果蝇基因内含子保守序列及新的非编码RNA的系统分析

4.1 与snoRAN共转录的新的非编码RNA候选基因的鉴定

4.2 果蝇内含子以及与已知非编码RAN的关系

4.2.1 比较基因组学方法鉴定非编码RNA的的高效性

4.2.2 已知的非编码RNA在不同大小内含子中的分布特点

4.2.3 果蝇全基因组的内含子长度分布统计

4.3 内含子中保守序列的获取和分析

4.3.1 内含子保守序列的获取

4.3.2 内含子保守序列功能的预测

4.4 五种新的非编码RNA候选基因的鉴定

4.4.1 两种新的内含子区域的miRNA基因的鉴定

4.4.2 两种新的内含子非编码RNA候选基因的鉴定

4.4.3 一种内含子反义链上的非编码RNA候选基因的鉴定

4.5 讨论

4.5.1 比较基因组学方法鉴定非编码RNA的优点和缺点

4.5.2 新的非编码RNA的功能的预测分析

4.5.3 Minimal intron的分析

4.5.4 内含子中大量候选的顺式因子及功能的讨论

4.5.5 不同基因家族的内含子的分布特点及功能分析

总结和展望

参考文献

缩略词

在学期间发表的学术论文

致谢

论文原创性声明