低氧环境下蛋白酶体β5亚单位（PSMB5）过表达对人晶状体上皮细胞的影响及其作用机制的实验研究

摘要

白内障是全球最主要的致盲性眼病。虽然白内障超声乳化吸除术联合人工晶体植入术是目前治疗白内障最理想的方法，但是手术需要大量的人力物力，而且术后并发症的发生以及人工晶体缺乏调节等不足之处都严重影响了病人的生存质量。因此，寻求预防和延缓白内障发生发展的方法一直是眼科研究领域内的重点之一。晶状体在老化的过程中受到各种因素的影响，如氧化、紫外线照射等。而氧化因素能引起晶状体上皮细胞凋亡、晶状体蛋白变性、交联，失去正常功能，因此被认为是导致年龄相关性白内障形成的重要因素。蛋白酶体系统是细胞内蛋白降解的主要途径之一，参与大多数短寿命蛋白以及变性蛋白的降解。晶状体上皮细胞内存在着完整的蛋白酶体系统，因此我们推测蛋白酶体在保护晶状体免受氧化损伤方面发挥重要作用。 一、年龄相关性白内障与透明晶体上皮内蛋白酶体活性的比较 目的：比较老年性白内障晶体上皮与透明晶体上皮内蛋白酶体的糜蛋白酶样(chymotrypsin-like)、胰蛋白酶样(trysin-like)酶活性是否存在差异，进而探讨蛋白酶体在老年性白内障发生发展中的作用机制。 方法：白内障晶体囊膜取自来我院行白内障超声乳化及人工晶体植入的患者，透明晶体囊膜取自广东省眼库，年龄与白内障病人相匹配。 结果：透明晶体上皮的蛋白酶体活性明显高于白内障组(P＜0.01)；皮质型与非皮质型白内障晶体上皮的糜蛋白酶样酶活性无明显区别(P＞0.05)；MG-132明显抑制各组蛋白酶体的活性。 结论：与透明晶体相比，白内障晶状体上皮内蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样酶活性明显降低，蛋白酶体活性降低可能在老年性白内障的形成中起重要的调节作用。 二、真核表达载体pcDNA3.1(+)/PSMB5质粒构建与鉴定 目的：构建蛋白酶体β5(PSMB5)基因真核表达质粒，进而探讨蛋白酶体在年龄相关性白内障的形成发展中所起的作用。 方法：从人晶状体上皮细胞株SRAO1/04中提取总RNA，RT-PCR扩增获得PSMB5的全长cDNA片段，克隆至真核表达载体pcDNA3.1上，并进行酶切鉴定和测序分析。结果：RT-PCR法扩增出约800bp的PSMB5基因全部编码序列的片段。酶切鉴定和测序分析证实所插入的PSMB5的基因序列完全正确。 结论：成功的构建了蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)基因真核表达重组质粒，为PSMB5在白内障形成中的作用提供基础。 三、pcDNA3.1-PSMB5转染真核细胞及表达 目的：将重组质粒pcDNA3.1-PSMB5转染人晶状体上皮细胞并检测其表达，为进一步研究蛋白酶体在年龄相关性白内障发病机制所起的作用打基础。 方法：取细胞处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，当细胞生长融合至60-70％，将2μg纯化的质粒DNA溶于100μl无血清的DMEM，加入10μl转染试剂混匀，，室温下孵育。吸去细胞培养液，，将转染混合液加入600μlDMEM培养液(含血清及抗生素)并混匀。37℃，5％CO2条件下培养3小时，弃去转染液，加入2ml含15％血清的DMEM培养液继续培养。细胞生长48小时后传代，并加入G418(终浓度700μg/ml)筛选。5天后当对照细胞大部分死亡时，更换一次筛选液，G418浓度降至300μg/ml。3周后挑取细胞克隆，重复上述筛选过程一次。转染后48小时提取总RNA检测PSMB5基因mRNA的表达情况，提取转染细胞克隆的蛋白，western检测PSMB5蛋白的表达情况。结果：利用QIAGENSuperfect转染试剂将真核表达质粒pcDNA3.1-PSMB5和空质粒pcDNA3.1转入人晶状体上皮细胞，经G418筛选，14天后可见抗性细胞克隆出现，证明质粒转染成功并有G418抗性基因表达。培养48小时的转染细胞吸去培养液后，用冰预冷的PBS洗三次，加入1mlTrizol，氯仿、异丙醇提取RNA，测定浓度。经RT-PCR后取3μl扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像分析仪处理。β-actin作为内参。凝胶电泳结果显示转染pcDNA3.1-PSMB5的人晶状体上皮细胞组PSMB5基因的mRNA表达明显高于其他组。Western检测结果显示，转染空载体pcDNA3.1组在22KD(PSMB5)处有少量显色条带，而转染pcDNA3.1-PSMB5组在22KD处出现较强的显色带。结论：本研究首次将重组真核表达载体pcDNA3.1-PSMB5转染人晶状体上皮细胞株SRA01/04。转染48小时后PSMB5基因的mRNA表达显著增加，western检测单克隆转染细胞，PSMB5蛋白表达明显增加，表明重组真核表达载体转染人晶状体上皮细胞成功。 四、低氧环境下蛋白酶体β5亚单位过表达对晶状体上皮细胞代谢的调节机制 目的：观察低氧环境下蛋白酶体β5亚单位对人晶状体上皮细胞的保护作用，从而探讨蛋白酶体在年龄相关性白内障形成中所发挥的作用。 方法：细胞用不含酚红和血清的DMEM-H2O2处理。细胞生存能力用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定；Hoechst33342染色观察细胞核形态；流式细胞仪检测凋亡率；测定糜蛋白酶样活性以及细胞内羰基化蛋白含量。 结果：①不同浓度H2O2处理细胞后，结果表明H2O2对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性。H2O2处理的PSMB5转染组与未转染组之间存在着显著性差异，未转染组更明显受到抑制。 ②Hoechst33342染色结果显示，20μMH2O2处理的PSMB5转染组与未转染组无显著性差异。然而，60μMH2O2处理后，与PSMB5转染组相比，未转染组的细胞核明显收缩、浓缩。这表明PSMB5对H2O2诱导的细胞凋亡具有保护作用。 ③各组细胞用20μM及60μMH2O2处理24小时。20μMH2O2处理24小时后，PSMB5转染组与未转染组无显著性差异，表明各组细胞能够耐受此浓度的H2O2。而60μMH2O2处理24小时后，PSMB5转染组与未转染组细胞凋亡的比率显著增高，但是未转染组的凋亡率增加的更为显著。 ④与未转染PSMB5的细胞相比，PSMB5转染细胞的蛋白酶体糜蛋白酶样酶活性增高，表明转染的PSMB5基因在细胞内成功表达。各组样本经20μM及60μMH2O2处理4小时后，发现20S蛋白酶体糜蛋白酶样酶活性无显著性差异。而各组样本经20μM及60μMH2O2处理24小时后，蛋白酶体糜蛋白酶样酶活性均受到抑制，但是未转染细胞比PSMB5转染细胞受到更明显的抑制，糜蛋白酶样酶活性降低更显著。 ⑤在正常培养条件下，细胞内就有羰基化蛋白存在，但是含量很低。当细胞处于60μMH2O2的低氧化压力的环境下，细胞内羰基化蛋白的含量却明显增加。与PSMB5转染组相比，未转染组细胞内羰基化蛋白的含量显著增加，统计学具有显著性差异。 结论：在低氧环境下，过度表达PSMB5基因能提高人晶状体上皮细胞SRA01/04的生存能力、降低细胞凋亡率，减少细胞内氧化蛋白含量，从而发挥了细胞保护作用。因此认为，PSMB5基因参与了年龄相关性白内障的形成。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一章年龄相关性白内障与透明晶体上皮内蛋白酶体活性的比较

第二章真核表达载体pcDNA3.1(+)/PSMB5质粒构建与鉴定

第三章pcDNA3.1-PSMB5转染真核细胞及表达

第四章低氧环境下蛋白酶体β5亚单位对晶状体上皮细胞代谢的调节机制

全文结论

参考文献

附 图

致 谢

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