四价Aβ基因工程肽疫苗对恒河猴的免疫原性及安全性评价

摘要

老年性痴呆(Alzheimerdisease，AD)是好发于中老年人的一种中枢神经系统退行性疾病，以记忆丢失及认知功能障碍为典型临床表现。主要病理改变为患者脑内出现β-淀粉样蛋白形成的老年斑，神经纤维缠结及神经元丢失。随着研究的深入，发现β-淀粉样蛋白(βamyloidpeptide，Aβ)在AD的发病机理中占据重要地位。为此，以Aβ为靶的AD治疗方法成为新的亮点。1999年Schenk等在NATURE杂志上首次报道用Aβ42全肽免疫治疗AD转基因动物模型。实验结果显示，Aβ42全肽疫苗免疫不仅可诱导PDAPP鼠体内产生特异性抗体，而且可阻止并减少鼠脑内Aβ的聚集。此后不断有研究表明主动免疫和被动免疫均能够清除或抑制AD转基因模型鼠脑内的Aβ沉积，并明显改善其认知功能和行为学。在此基础上，Elan公司于2001年研制并开发出一种AD疫苗AN1792，但在Ⅱ期临床实验中，因为有6％的接种对象出现了无菌性脑膜脑炎，实验被迫终止。随后的尸检结论为：患者脑组织中存在T细胞和巨噬细胞浸润，由此可推断Aβ42肽C末端的T细胞表位可能激发了Th1反应，从而诱发人体内T细胞的过度活化并导致炎症反应发生。于是研究者不约而同着眼于既能避免T细胞介导的主动免疫发生，又有效引发抗体生成的新型疫苗研究。且由于DNA重组技术的不断创新，AD基因工程亚单位疫苗的研制成为研究热点。 目的 本研究利用基因工程方法制备的四价Aβ1-15基因工程肽疫苗，配伍Th2型佐剂MF59，免疫接种成年恒河猴，观察其体液和细胞免疫学效应以及安全性，为四价Aβ1-15基因工程肽疫苗的临床应用提供实验基础。 材料和方法 1.疫苗的制备及接种 4×Aβ1-15经表达纯化后，接种前与MF59按1∶1(v∶v)的比例混合，混匀并乳化成功，即为接种用疫苗，终浓度为200μg/mL。 6只健康雄性成年恒河猴，随机分为2组，其中4×Aβ1-15组4只，未接种疫苗组2只。每次均经三角肌内接受疫苗注射，每侧各0.5mL，200μg/次，并分别于第0、2、4、6周接受疫苗接种，共免疫接种4次。 2.疫苗接种成年恒河猴的体液免疫效应观察 疫苗接种前1周采血1次，每次接种疫苗后2周采血1次，最后一次接种后4周再次采血1次。每次采血量均为5mL。间接ELISA法检测恒河猴血清中抗Aβ42抗体的水平；桥联ELISA法检测血清抗Aβ42IgG亚类；免疫组化法观察血清抗Aβ42抗体与AD转基因小鼠脑组织内的老年斑结合情况。 3.疫苗接种成年恒河猴的细胞免疫效应观察 第4次疫苗接种后2周，采集恒河猴静脉血，分离外周血单核细胞(PBMC)，用4×Aβ1-15刺激培养的PBMC。3H-TDR法测定4×Aβ1-15刺激对淋巴细胞的增殖作用；ELISA双抗体夹心法检测4×Aβ1-15刺激后培养液中IFN-γ和IL-4的水平。 4.疫苗接种成年恒河猴的安全性评价 观察记录疫苗接种后，恒河猴的全身状况以及接种部位的情况；于初次免疫前1周及第4次疫苗接种后2周，分别检查恒河猴的血常规和肝肾功能；HE染色观察疫苗接种后恒河猴的肝、脾的组织结构，六胺银染色观察肾小球基底膜的形态结构；Perls法染色观察脑组织出血情况。 结果 1.疫苗接种成年恒河猴的体液免疫效应观察 第1次疫苗接种后2周检测，恒河猴体内没有抗体产生。第2次接种后2周，部分恒河猴体内产生低滴度的抗体。第3次疫苗接种后2周，所有试验恒河猴血液中均产生明显的抗Aβ42抗体(1∶1760)，而且随着接种次数的增加，抗体的滴度迅速升高。第4次疫苗接种后2周，抗体的平均滴度达到1∶5600。第4次接种后停止免疫，于4周后再次检测抗体水平仍维持在1∶5400。 ELISA检测的结果表明，在3个稀释度(1∶100，1∶200，1∶400)的血清中，4×Aβ1-15组恒河猴血清中抗Aβ42抗体的IgG均以IgG1和IgG2为主，抗体亚型含量依次为IgG1＞IgG2＞IgG3＞IgG4，且IgG2/IgG1＜1。 疫苗接种后，恒河猴血清中的抗Aβ42抗体都能与Tg2576转基因小鼠脑组织内的Aβ斑结合。光镜下可见转基因小鼠脑组织内的Aβ斑被染成棕色或棕褐色，形态不一。 2.疫苗接种成年恒河猴的细胞免疫效应观察 体外培养的4×Aβ1-15组和对照组恒河猴的PBMC经特异性抗原刺激后，4×Aβ1-15组在刺激抗原剂量为5μg/L和10μg/L时，cpm值分别为6592.38±1233.45、8321.37±1058.84，而对照组在刺激抗原剂量为5μg/L和10μg/L时，cpm值分别为1433.75±240.70、1585.33±301.91，SI刺激指数分别为2.67±0.5、3.43±0.86和1.27±0.22、1.32±0.34，其中4×Aβ1-15组能有效刺激抗原特异性的淋巴细胞增殖(SI＞2)，4×Aβ1-15组与对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。 体外培养的4×Aβ1-15组恒河猴的PBMC经特异性抗原刺激后，细胞培养液中IFN-γ的含量和IL-4的含量分别为7.42±2.04pg/mL、15.44±4.01pg/mL，对照组恒河猴的PBMC经特异性抗原刺激后，细胞培养液中IFN-γ的含量和IL-4的含量分别为4.49±1.31pg/mL、＜4pg/mL。其中，4×Aβ1-15组IFN-γ的含量较IL-4低，4×Aβ1-15组与对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。 3.疫苗接种成年恒河猴的安全性评价 实验期间，疫苗接种组恒河猴外观正常；一般状况良好，未见神经系统病理症状；注射部位未见明显炎症反应。疫苗接种后第2天体温明显升高，第3天体温继续升高达到最高，稍高于正常体温，其后体温开始下降，并于接种后第7天下降至接种前水平。此后疫苗接种后体温变化类似。疫苗接种后，恒河猴的肝、脾未见组织结构的病理改变，肾小球基底膜完整；Perls染色呈阴性反应，表明疫苗接种未导致恒河猴脑组织出现出血迹象。 结论 1.四价Aβ1-15基因工程肽疫苗能有效刺激成年恒河猴发生特异性的体液免疫应答，诱导产生的抗体能与Tg2576小鼠脑组织内的SP结合。上述结果表明，四价Aβ1-15基因工程肽疫苗能产生高滴度的特异性抗Aβ42抗体(最高滴度达1∶5600)，具有良好的免疫原性。 2.四价Aβ1-15基因工程肽疫苗接种恒河猴后，血清中抗Aβ42抗体的IgG亚型以IgG1和IgG2为主，IgG2/IgG1＜1。接种恒河猴的PMBC体外经4×Aβ1-15刺激后，有淋巴细胞增殖反应，且细胞培养液中IL-4的含量较IFN-γ高。上述结果表明，4×Aβ1-15疫苗接种成年恒河猴，可以诱导产生Th2细胞极化优势的细胞免疫应答，从而可能避免出现Th1细胞极化优势的细胞免疫应答所引起的不良反应。 3.四价Aβ1-15基因工程肽疫苗接种恒河猴后，未见出现明显的局部及全身反应，血常规及肝肾功能指标正常，肝、脾和肾脏的形态未出现损害表现，脑内没有出血发生，表明四价Aβ1-15基因工程肽疫苗具有良好的安全性。 4.四价Aβ1-15基因工程肽疫苗接种恒河猴后，与MAP-Aβ1-15在免疫原性、安全性评价上获得的结果相似，加之生产、纯化上的优势。四价Aβ1-15基因工程肽疫苗取代MAP-Aβ1-15将成为可能。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附录 实验猕猴观察项目表

英文缩略词表

致谢

原创性声明