骨形态发生蛋白-4对人原始卵泡体外存活和生长发育影响的实验研究

摘要

女性卵巢皮质内的大量原始卵泡构成维持其一生生殖活动的卵泡库，但在生理情况下女性从青春期卵巢初步具备生殖能力到围绝经期卵巢功能趋向衰竭，卵泡库中仅约1％的卵泡能够成熟并排出卵子，绝大多数卵泡在不同的发育阶段退化闭锁。而随着医学技术的进步，癌症患者经抗癌治疗后生存率显著提高，但女性患者经过抗癌治疗后将面临卵巢功能衰竭的危险。与此同时，现代社会越来越多的女性由于职业竞争压力增大而不得不一再推迟生育，使得在最佳生育年龄排出的卵子无法利用，等到希望生育时，由于卵巢内多数卵子已排出造成卵巢生殖能力下降，以及年龄增长对卵子质量的负面影响等原因而引起不孕不育，而且也给优生优育带来隐患。如果能将女性的生殖资源保存起来，充分利用卵泡库，不仅能为接受抗癌治疗的女性提供生殖保险，减少由于生育问题引起的家庭和社会矛盾，而且能解除职业女性的后顾之忧，解决其不孕不育以及优生优育问题，必将带来巨大的经济效益和社会效益，于是卵巢生殖能力的保存成为近年来生殖医学研究的热点之一。 相对于药物保护卵巢、卵巢手术移位、胚胎冷冻保存、卵子冷冻保存和卵子赠送等保存女性生殖能力的方法，卵泡体外培养尤其是联合卵巢组织冷冻保存以及卵巢组织移植，由于具有卵巢组织取材不依赖于月经周期、不需要超排卵刺激卵巢、不耽误患者的疾病治疗等优点，被认为是一种较有前途的保存卵巢功能的方法。 哺乳动物原始卵泡体外生长和成熟的能力在1996年由Eppig和O'Brien首先证实，他们将小鼠的原始卵泡在体外培养成熟，并经体外受精和胚胎移植后获得成活小鼠，这为利用原始卵泡进行体外生长(invitrogrowth，IVG)、体外成熟(invitromaturation，IVM)和体外受精(invitrofertilization，IVF)获得成活后代以保存女性生殖功能提供了可能。虽然近年来许多生殖中心在IVM方面取得了可喜的成绩，但人类原始卵泡的体外培养技术还没有取得突破，原始卵泡的启动机制还不明确，需要我们进行更多的探索。 在卵泡生长发育过程中原始卵泡向初级卵泡转化和初级卵泡向次级卵泡转化被认为是卵泡生长过程中的限速步骤。目前我们对有关原始卵泡向初级卵泡转化的机制了解甚少，有实验显示分离后卵泡或卵巢皮质在体外培养时原始卵泡可以在无性激素的条件下转化为初级卵泡，动物实验也证实在切除垂体的大鼠中同样可以观察到原始卵泡向初级卵泡的过渡，推测这一过程是不依赖性激素的，启动原始卵泡生长的确切物质和机制仍有待于进一步阐明。 卵泡闭锁是卵母细胞通过一定机制而湮没的过程，是卵泡生长过程中的必要环节之一，卵泡闭锁的出现调整了生殖细胞的储备量，导致了两次生殖细胞储备量的下调。卵泡闭锁的本质可能是细胞凋亡，几种促存活和促凋亡分子参与了卵泡凋亡的发生，两类分子复杂的平衡调节决定了卵泡的最终命运，对这些分子的进一步研究将有利于降低卵泡体外培养过程中的卵泡丢失，有助于对卵巢组织中卵泡资源的充分利用和女性生殖能力的保存。 近年来，人们在探索原始卵泡向初级卵泡转化机制及降低卵泡体外培养过程中卵泡闭锁率时，逐渐将目光转向生长因子，尤其是卵巢自身调节系统的组成成员，已有证据表明卵巢组织来源的转移生长因子超家族中的骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMPs)家族参与了这一过程。 BMPs是转移生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族中最大的一个家族，至今已有约15种BMP被报道。其中BMP-4的最初命名是由于其在骨和软骨代谢中的作用，后来的研究显示BMP-4参与胚胎中胚层形成的调节、原始生殖细胞的形成、肢芽调节和发育过程中多种器官系统的形成，其在哺乳动物卵巢中的功能由Shimasaki等在1999年报道。目前认为BMP-4在小鼠卵巢中的表达部位是卵泡膜细胞，而其受体是在颗粒细胞和卵母细胞中表达。实验发现，BMP-4可以促进小鼠颗粒细胞FSH诱发的雌二醇分泌，同时降低孕激素的分泌，被称为“黄体化抑制剂”，来自羊的实验还发现，BMP-4不仅可以抑制FSH刺激的孕激素分泌，还可以抑制孕激素的基础分泌。在新生小鼠卵巢的体外培养过程中发现，外源性BMP-4可以促进原始卵泡向初级卵泡的转化，而加入BMP-4特异性中和抗体后卵巢体积明显缩小，卵泡数量明显减少，凋亡阳性细胞明显增加，卵巢组织形态丧失，说明BMP-4在卵泡生长发育和存活方面可能发挥重要作用。 本实验通过在卵巢组织体外培养过程中加入重组人BMP-4，了解其在人类原始卵泡向生长卵泡转化方面的作用，分析其对卵泡基础雌孕激素分泌的影响，观察对培养过程中卵泡、卵巢间质细胞存活的影响，为进一步研究卵泡生长转化机制和卵泡体外培养技术的后期临床应用提供理论基础和实验依据。 材料与方法 1.组织来源 选取中山大学附属第二医院妇产科2005年5月至11月进行卵巢切除手术的女性患者34例作为研究对象，患者年龄29.96±5.14岁(14～38岁)，有规律月经、无内分泌紊乱、无放化疗史、半年内无激素服用史且卵巢囊肿直径＜7cm，该实验得到本院生殖医学伦理委员会的批准并与患者签署知情同意书。 2.实验方法 2.1组织培养： 将在开腹或腹腔镜下获得的卵巢组织标本立即放置在室温保存的HEPES-MEM培养液中，30分钟内送至实验室，在室温下用HEPES-MEM培养液冲洗两次后，移入装有该液体的培养皿中。在解剖显微镜下用外科刀片修剪卵巢标本并切除卵巢髓质，然后将卵巢皮质切成2mm×2mm×1mm的皮质片，将来自同一患者的皮质片随机分为研究组(即BMP-4组)、对照组和未培养组，研究组和对照组于37℃，5％CO2培养箱中培养15天，每隔两天更换400μl培养液，更换过的培养液收集到EP管中于-20℃保存，培养结束后进行雌孕激素测定。 2.2组织学检查和凋亡分析： 未培养组、体外培养15天后的对照组和研究组卵巢组织用10％福尔马林固定后行组织学检查，切片厚度5μm，HE染色后阅片，每个标本观察10个高倍镜视野，计数其中原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡，计算三组原始卵泡和生长卵泡(包括初级和次级卵泡)所占百分比；同时选取对照组和研究组具有卵泡的切片行细胞凋亡检测(TUNEL)，细胞核内出现明显的弥散性或颗粒性深蓝色染色定为凋亡阳性细胞，卵母细胞内或/和≥50％颗粒细胞出现阳性TUNEL染色计为凋亡卵泡，10个高倍视野下(×400)计数卵泡和间质细胞凋亡阳性细胞数，分别计为卵泡凋亡指数(apoptoticindexoffollicle，AIF)和间质细胞凋亡指数(apoptoticindexofstromacell，AIS)。 2.3雌孕激素测定： 所有组织培养结束后，将贮存的装有更换过培养液的EP管于室温下解冻，并将每一标本的培养液集中于测定管中，用ACS：180自动化学免疫发光仪进行培养液中雌孕激素测定。 结果 1.BMP-4对卵泡生长发育的影响 未培养组、对照组和研究组平均10个高倍镜视野下观察到的卵泡个数分别为4.14±3.56、3.14±3.04、3.38±2.36，三组之间无统计学差异。培养结束后对照组和研究组平均有57.59％±34.63％和47.87％±39.99％的卵泡处于原始卵泡阶段，显著低于未培养组的原始卵泡所占比例90.97％±9.12％，P＜0.01，而对照组和研究组之间无统计学差异。 培养15天后，在研究组和对照组平均有52.13％±39.99％和42.41％±34.63％的卵泡是生长卵泡，两组之间差异无显著性，但明显高于未培养组的生长卵泡所占比例9.03％±9.11％，P＜0.01。 2.BMP-4对基础雌孕激素分泌的影响 培养15天后，对照组和研究组培养液中雌二醇的含量分别是1347.83±738.36ng/ml和946.67±476.02ng/ml，无统计学意义(P＞0.05)；孕激素的含量分别是5.91±3.54μg/l和3.57±2.04μg/l，研究组孕激素浓度明显降低，有统计学意义，P＜0.01。 3.BMP-4对卵泡和间质细胞存活的影响 TUNEL切片中，对照组和研究组分别计数68和89个卵泡，未发现卵泡凋亡；两组间质细胞的凋亡指数分别是0.41±0.16和0.16±0.08，研究组间质细胞凋亡指数明显低于对照组，有统计学意义，P＜0.01。 结论 1.重组人BMP-4有助于人类卵巢组织体外培养中原始卵泡向初级卵泡的转化； 2.BMP-4可以显著降低体外培养中颗粒细胞孕激素的基础分泌； 3.BMP-4可以显著抑制卵巢组织体外培养过程中间质细胞的凋亡，有助于维持卵泡和周围细胞之间信号传导的完整性，有利于提高卵泡体外存活能力。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

总结与展望

结论

参考文献

英文简略词

附图

致谢

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