快速反向点杂交HPV基因分型——方法建立及其与宫颈病变关系的研究

摘要

宫颈癌是仅次于乳腺癌导致妇女死亡的第二大恶性肿瘤，我国每年新发病例13.15万，每年约5万人死于宫颈癌。研究表明人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是引起宫颈癌的直接病因，大多HPV感染是一过性的，只有高危型HPV的持续感染或反复感染才能导致宫颈癌的发生。 人乳头瘤病毒是乳多空病毒科A属成员，为双链闭环DNA病毒，基因组长度7200-8000bp，可分为3个区段：早期区、晚期区及长控制区。早期区与晚期区有八个主要开放读码框架，与DNA复制，转录调控及细胞转化有关。 目前确定的HPV型别约有120余种，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道型HPV，大约40种型别涉及生殖道感染，依据不同型HPV感染导致宫颈癌发生的危险性高低，HPV分为低危型和高危型。HPV检测及基因分型对宫颈癌的预防、诊断以及治疗有重要的指导意义。本文建立了一种快速反向点杂交方法对HPV基因分型并对珠三角地区21型常见HPV基因型分布以及HPV感染与不同宫颈病变的关系进行了研究。 目的 本研究设计合成21型HPV特异型别探针(包括15种高危型和5种低危型及cp8304型)，应用DNA杂交仪建立一种快速反向点杂交(ReverseDotBlot，RDB)HPV基因分型方法，并对该系统进行评价。同时利用该方法检测珠三角地区临床标本，分析珠三角地区21型常见HPV基因型分布情况，探讨不同基因型与宫颈病变的临床关系。 方法 收集广东省人民医院妇产科门诊病例355例，按薄层液基细胞学检测结果(BethesdaSystem1999分级系统)将病例分为五组：NILM、ASC-H、ASCUS、LSIL、HSIL。选取通用引物MY09/11和内参Globin引物GH20/PC04，引物用生物素标记；根据21型序列比对结果设计HPV21种亚型的特异性探针，其中包括15种常见高危型和5种低危型及cp8304型，同时设计了内参基因Globin探针，探针均用氨基标记；对临床标本进行PCR扩增和快速反向点杂交分型检测。经过对临床标本的筛选，制备HPV不同型别阳性标准模板。应用DNA杂交仪进行杂交，并分别对探针浓度、杂交温度、杂交时间三个条件进行优化，建立快速反向点杂交HPV基因分型方法；同时利用FDA认证的杂交捕获Ⅱ代方法对临床标本进行HPV检测，比较两种方法检测结果，对快速反向点杂交分型方法进行系统评价。此外，利用快速反向点杂交对珠三角地区临床标本进行21常见HPV基因分型，了解珠三角地区HPV基因型分布情况。 结果 一、快速反向点杂交HPV基因分型方法的建立及评价 1.成功建立快速反向点杂交对HPV基因分型 提取标本DNA质量完好，21型HPV基因型阳性模板重组质粒经测序证实。系统最佳条件为：探针浓度为15pmol/μl，杂交温度为45℃，杂交时间为10分钟。21型临床标本经快速反向点杂交检测分型，蓝色斑点清晰可见，各型别间无非特异显色；快速反向点杂交检测HPV基因型最低限度为102-104copies。 2.基因分型结果 通过快速反向点杂交进行基因分型，355例宫颈刷标本中共检测出阳性标本211例(59.4％)，其中单型感染有150(71.1％)例，混合感染61例(28.9％)。共检测出15种常见高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)以及3种低危型(6、11、42)。另有两例PCR扩增电泳结果呈阳性，分型无结果，经克隆测序鉴定后分别为73型和54型。 3.杂交捕获Ⅱ代(hybridcapture，HCⅡ)方法和快速反向点杂交进行HPV分型的结果比较 355例标本中，杂交捕获Ⅱ代方法和快速反向点杂交分别检测出222例和211例阳性标本，以HCⅡ为标准，快速反向点杂交的灵敏度为92.8％(206/222)，特异度为96.2％(128/133)。两种方法比较χ2值0.72，取得了较好的一致性。 二、珠三角地区HPV型别分布以及各基因型与不同宫颈病变关系 1.珠三角地区21型常见HPV基因型分布 利用快速反向点杂交分型方法对1085例标本进行HPV基因分型，共检测出437例HPV感染病例，总阳性率为40.3％，其中单型感染有319例(73.0％)；混合感染有118例(27.0％)，共检出23种HPV型别，其中包括16种高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73)和6种低危型(6、11、42、43、44、54)以及cp8304型。在23种型别中，感染率最高的为16型(24.5％)，其次为52型(16.2％)、58型(16.0％)、56型(7.3％)、31型(6.9％)等。 2.生殖道HPV感染基因亚型分布与不同宫颈病变的关系 355例病例中不同宫颈病变HPV感染率有所不同，χ2为50.56，P＜0.05显示不同的宫颈疾病中HPV感染率存在差异。NILM、ASC-H、ASCUS、LSIL、HSIL组中利用快速反向点杂交和HCⅡ方法检出HPV感染率分别为43.3％/46.4％、50.0％/50％、74.1％/79.5％、80.8％/82.2％、91.7％/95.8％；随着宫颈疾病程度的加重，HPV的感染率也随之增高。宫颈病变程度不同HPV感染的基因型也存在差异。各疾病组型别分布情况存在不同：ASCUS中前四位感染型别为16、52、58、56。而在LSIL中前四位感染型别为58、16、52、56。在HSIL组中前四位感染型别为16、58、33、52，感染率分别为54.2％、12.5％、8.3％、8.3％，HSIL组中16型感染率超过了50％。 结论 1.本研究成功建立了一种快速简便的反向点杂交HPV基因分型方法，并与杂交捕获Ⅱ代基因分型方法进行比较，两法取得了较好的一致性。 2.珠三角地区21型常见HPV基因型分布主要是HPV16、HPV52、HPV58、HPV56和HPV31；各型的感染率分别是24.5％、16.2％、16.0％、7.3％、6.9％。 3.不同宫颈病变中，HPV感染率与型别分布均不同。良性宫颈病变ASC-H、ASCUSLSIL组中感染率分别为50.0％、74.1％、80.8％；恶性HSIL组中感染率为91.7％；随着宫颈病变程度增加HPV感染率明显升高。宫颈病变程度不同，HPV感染的基因型别也存在差异。

目录

文摘

英文文摘

引 言

第1章快速反向点杂交HPV基因分型方法的建立及评价

第2章珠三角地区HPV型别分布以及各基因型与宫颈病变关系

结论

参考文献

附录

英文缩略词表

致谢

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