腺病毒介导的人骨形成蛋白-7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究

摘要

本文研究目的：构建人骨形成蛋白-7(humanmorphogeneticprotein,hBMP-7)腺病毒载体并制备重组病毒液，检测经腺病毒介导hBMP-7基因转染的人牙髓细胞(dentalpulpcells,DPCs)中外源hBMP-7蛋白的表达，探讨hBMP-7基因转染对DPCs增殖及向成牙本质细胞分化的调节作用。为进一步开展牙髓暴露基因治疗的体外及临床研究提供实验依据。 研究方法：分别双酶切pSPORT6-hBMP-7质粒和PSU-CMV质粒，回收并纯化hBMP-7cDNA片断和PSU-CMV质粒的大片断，使二者连接获得含有hBMP-7基因的重组穿梭质粒载体，酶切鉴定及测序以证实构建是否成功。采用位置特异性重组方法构建hBMP-7基因重组腺病毒载体。用脂质体介导PSUCMV-hBMP-7和Pbhge3共转染293细胞产生hBMP-7基因重组腺病毒，经293细胞扩增，纯化制取高滴度重组腺病毒。以相同的方法扩增和纯化Ad-EGFP。检测Ad-EGFP对牙髓细胞的转染效率，以确定Ad-hBMP-7的MOI，用携带外源性目的基因的腺病毒感染人牙髓细胞，Westernblot鉴定重组腺病毒目的基因的表达情况。四唑盐比色法(MTT)、酶动力学法、VonKossa染色及半定量RT-PCR分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节和牙本质涎磷蛋白mRNA(DSPPmRNA)的表达情况。 研究结果：用位置特异性重组方法成功构建了携带hBMP-7基因的重组腺病毒载体(Ad-hBMP-7)，其滴度约为1.785×109pfu/ml，确定Ad-hBMP-7对人牙髓细胞的最佳感染复数为75；Westernblot检测出人骨形成蛋白-7的表达；经Ad-hBMP-7转染的人牙髓细胞增殖能力无明显改变，同时其合成ALP的能力能够得到显著提高，矿化结节形成，DSPPmRNA的表达呈剂量和时间依赖性。 研究结论：Ad-hBMP-7转染人牙髓细胞后可高效稳定表达。Ad-hBMP-7显著促进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化，而对细胞的增殖无明显改变。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一部分重组人骨形成蛋白-7基因腺病毒表达载体的构建及鉴定

第二部分腺病毒介导hBMP-7基因转染人牙髓细胞及其表达

第三部分Ad-hBMP-7对人牙髓细胞生物学的影响

全文结论

参考文献

缩略词注解

基因治疗载体的研究进展

致 谢