经转基因修饰的自体骨髓间充质干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良模型鼠的实验研究

摘要

Duchenne型肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一种X连锁隐性遗传病，以进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征，是最常见的神经肌肉疾病。患者多于20岁左右死于呼吸衰竭和／或心力衰竭。其病因是由于X染色体的抗肌萎缩蛋白基因突变，导致其编码的细胞骨架蛋白Dystrophin(Dys)缺乏。 以上每种方法都有其局限性，如果分离培养病人的自体细胞，转入正常的Dys基因再回输到病人体内，那么就可以避免发生免疫反应。为了使目的基因长期稳定的整合到骨髓干细胞，本研究拟构建含Dys基因的逆转录病毒，对骨髓间充质干细胞进行遗传修饰后，经尾静脉注入mdx鼠体内，使其到达肌肉组织并观察是否可以分化成肌肉细胞，对受损的肌肉细胞进行修复，促进肌肉再生。 1材料和方法 1.1实验动物 Mdx鼠(6-8周)20只作为供体鼠，mdx鼠30只分为未治疗组5只(12—16周)和移植治疗组25只(7—9周)。将含micro—dystrophin基因的mMSCs从尾静脉到mdx鼠体内，分别于移植后4周、8周、12周取材。细胞移植各组中死亡的mdx鼠退出试验，保持各组、各时间点动物为5只。 1.2实验方法 1.2.1 PBSK-MICRO、pLNCX2的转化、扩增和鉴定制备大肠杆菌的感受态细胞，将质粒PBSK-MICRO、pLNCX2逆转录病毒载体转化感受态细菌进行扩增，碱裂解法提取质粒，酶切鉴定。 1.2.2 micro—dystrophin逆转录病毒载体构建及鉴定将质粒PBSK-MICRO、pLNCX<,2>逆转录病毒载体转化感受态细菌进行扩增，提取部分菌液的质粒进行Not I酶切，凝胶回收酶切产物，在T4DNA 连接酶的作用下构建pLNCX2-micro-dystrophin逆转录病毒载体，提取质粒以HindⅢ进行酶切鉴定，筛选出正确插入的重组质粒pLNCX2-micro-dystrophin。采用Sanger法进行测序并与Gerlebank中序列进行对比。 1.2.3含micro-dystrophin的逆转录病毒的包装、病毒滴度测定及可复制型逆转录病毒的检测经LipofectamineT<'TM>2000转染pLNCX2-micro-dystrophin和pLNCX2空质粒至生长良好的PA317细胞，G418筛选至阳性克隆形成，扩增阳性克隆细胞，收集上清，得到pLNCX2-micro-dystrophin病毒液(dys病毒液)和pLNCX2病毒液。收集dys病毒液，提取病毒颗粒，PCR检测病毒结构基因env的存在。 1．2．4 mMSCs的分离培养及鉴定应用L-DMEM培养mdx鼠骨髓干细胞，差速贴壁法分离、扩增及纯化MSCs，并进行表面抗原鉴定，将形态一致的P7代mMSCs用于移植。 1．2．5含miaro-dystrophin的逆转录病毒液感染mMSCs及目的克隆的筛选将细胞分为dys病毒液(感染组)、pLNCX2液感染组(阴性对照组)和未感染组。选择滴度较高的dys液和pLNCX2病毒液加入mMSCs中，吸附4小时后更换培养基，细胞继续培养48h后进行其短暂表达检测。 1．2．6含有micro-dystrophin的mMSCs成肌能力检测 向生长良好的含有micro-dyst：rophin的mMSCs培养基中加入5-氮杂胞苷(终浓度为10umol／1)，24h后换为正常培养基，观察是否有肌管形成，胚胎型肌凝蛋白重链(developmental myosin heavy chain，MHC)染色检测是否为肌管。 1．2．7尾静脉注射移转基因修饰的植mMSCs取鼠龄为7-9周的mdx鼠进行移植。将经筛选扩增的mMSCs尾静脉移植入mdx鼠，移植细胞数量为1.2X10<'2>／只。 1．2．8转基因修饰的mMSCs移植后致瘤、致畸性的观察mMSCs移植入mdx体内后在各时间点剖析各器官，观察其形态结构有无异常，有无肿瘤或者畸形的发生。 1.2.9转基因修饰的mMSCs移植后运动功能及CK值的测定在移植后12周，通过牵引实验和转棒实验检查治疗组受体鼠和对照组mdx鼠的运动功能。分别取移植后不同时间点及对照组鼠1.2ml血流入EP管，室温放置30分钟后离心(3000转／分钟X5分钟)，取血清约250Ul，用CK-NAC(日本第一化学)检测CK值。 1.2.10转基因修饰的mMSCs移植后肌肉组织的HE染色分别取移植后不同时间点及对照组radx鼠腓肠肌的冰冻切片进行常规HE染色，在镜下观察细胞形态，X400倍取5个视野，计数肌核中心移位纤维数目，并计算其比例。 1.2.11转基因修饰的mMSCs移植后micro-dystrophin的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测取移植后不同时间点及对照组mdx鼠的腓肠肌进行冰冻切片做免疫荧光染色、RT-PCR和Western Blot，检测micro-dystrophin的表达情况。 1.2.12转基因修饰的mMSCs移植后c-met及micro-dystrophin共表达的免疫荧光检测取移植后12w及对照组鼠的腓肠肌进行冰冻切片做免疫荧光染色、检测c-met及micro-dystrophin的共表达情况。 1.2.13转基因修饰的mMSCs移植后受体鼠腓肠肌SC的培养取移植后12w的受体鼠的腓肠肌，分离培养SC，检测micro-dystrophin和desmin的共表达情况，判断肌卫星细胞来源。 1.2.14转基因修饰的mMSCs移植后MyoD的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测取移植后不同时间点及对照组鼠的腓肠肌进行冰冻切片做免疫荧光染色、RT-PCR和Western Blot，检测MyoD的表达情况。 2结果 2.1micro-dystrophin逆转录病毒载体的构建和鉴定成功构建了含micro-dystrophin的逆转录病毒载体，经HindⅢ酶切鉴定后证实为正向连接，采用Sanger法测序结果显示插入的micro-dystrophin基因方向正确、无碱基错误和缺失。 2.2重组病毒液的制备、病毒滴度的测定及可复制型逆转录病毒的检测利用脂质体介导方法成功地将pLNCX2-micro-dystrophin和pLNCX2导入PA317包装细胞中，两组病毒液的病毒滴度在2.0×10<'3>-5.0×10<'5>cfu/ml之间。未检测到可复制型逆转录病毒。 2.3 mMSCs的分离培养及鉴定原代培养的mMSCs大约14天后可长满。以差速贴壁法原代培养的mMSCs，贴壁细胞多呈梭形，有宽大扁平的不规则形、三角形或多角形，体积明显比悬浮细胞大，细胞核多呈卵圆形，位于胞质中央，悬浮细胞一般经3-4次换液后除去。按1：2传代，每代大概生长3-5天。 2.4dys病毒液感染mMSCs及免疫荧光、RT-PCR检测感染后48h的mMSCs中micro-dystrophin的表达感染组mMSCs中可见有红色颗粒出现，深浅不一，而阴性对照组和未感染组MSCs未见红色颗粒；感染组的RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可见为319bp的DNA片断，说明micro-Dystrophin基因成功转入mMSCs并表达。 2.5 G418筛选感染dys病毒液成功的mYSCs阳性克隆并扩增成功筛选出阳性克隆形成(约3-4周)，扩增阳性克隆细胞，传代并证实可以稳定表达micro-dystrophin。 2.6含有micro-dystrophin基因的gMSCs成肌潜能检测在加入5-氮杂胞苷10天后，可观察到肌管形成，MHC染色证实为肌管，这表明经转基因修饰后的mMSCs在体外仍然具有成肌能力。 2.7转基因修饰的mMSCs移植后致瘤、致畸性的观察mMSCs移植后各时间点，机体各器官大体结构正常，均未发现有肿瘤或者肿瘤生成。 2.8转基因修饰的mMSCs移植后运动功能及CK值的变化治疗组运动功能没有明显改善；未治疗组mdx鼠CK值明显升高，移植后CK值有降低趋势。 3结论 3.1 mMSCs具有干细胞的表型并且可以向成骨细胞和脂肪细胞分化，证实该细胞具有多向分化潜能。 3.2 micro-dystrophin在mMSCs可以长期稳定的表达；携带外源基因的mMSCs仍然具有成肌潜能。 3.3转基因修饰的mMSCs移植后各组织器官均未发现肿瘤发生，因而携带外源基因的mMSCs移植是安全可靠的。 3.4转基因修饰的mMSCs移植后mdx鼠出现人特异性Dys表达，并且表达量随时间延长增加；少数细胞可作为肌卫星细胞长期存在；MyoD阳性细胞核增加，并且可以检测到myogenein和micro-dystrophin双阳性的细胞，表明移植的mMSCs可激活并分化为肌细胞。 3.5在mdx鼠，采取经转基因修饰的自体骨髓间充质干细胞移植治疗有一定的疗效，为临床治疗DMD提供了新的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

引言

一DMD疾病简述

二DMD动物模型

三Dys基因及蛋白结构功能分析

四DMD的治疗方法及进展

五细胞治疗和基因治疗相结合治疗DMD的可能性

六骨骼肌发育概述

七肌卫星细胞（satellite cell,SC）

八成肌调节因子在肌肉发生中的作用

九实验目的

材料和方法

一实验材料

（一）实验动物

（二）实验试剂

（三）实验器材

二实验技术与方法

（一）主要溶液的配制

（三）实验方法

三技术路线

结果

一micro-dystrophin逆转录病毒载体的构建和鉴定

二重组病毒液的制备、病毒滴度的测定及可复制型逆转录病毒的检测

三mdx鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）的培养和鉴定

四免疫荧光和RT-PCR检测感染后48h的mMSCs中micro-dystrophin的表达

五G418筛选感染dys病毒液成功的mMSCs阳性克隆并扩增

六含有micro-dystrophin基因的mMSCs成肌能力

七转基因修饰的mMSCs移植后对mdx鼠致瘤、致畸性的观察

八转基因修饰的mMSCs移植后mdx鼠运动功能及血清肌酸激酶变化

九转基因修饰的mMSCs移植后mdx鼠的肌肉组织病理检测

十转基因修饰的mMSCs移植后mdx鼠腓肠肌micro-dystrophin表达的动态变化

十一转基因修饰的mMSCs移植后12w mdx鼠腓肠肌micro-dystrophin和c-met表达检测

十二转基因修饰的mMSCs移植后12w受体鼠腓肠肌的肌卫星细胞的培养及鉴定

十三转基因修饰的mMSCs移植后mdx鼠腓肠肌MyoD的动态表达变化

十四转基因修饰的mMSCs移植后12w腓肠肌micro-dystrophin和myogenein的共表达

讨论

一micro-dystrophin

二mMSCS的生物学特性

三逆转录病毒

四转基因修饰的mMSCs移植后对mdx鼠的致瘤性

五转基因修饰的mMSCs移植后mdx鼠运动功能及肌酸激酶的变化

六转基因修饰的mMSCs移植入mdx鼠体内后肌肉组织病理变化

七转基因修饰的mMSCs移植后骨骼肌细胞可表达micro-dystrophin蛋白

八转基因修饰的mMSCs移植后可作为肌卫星细胞长期存活的初步探讨

九转基因修饰的mMSCs移植后MRFs的表达

十转基因修饰的mMSCs移植入mdx鼠体内向骨骼肌细胞分化的机制探讨

结论

参考文献

英文缩写词

附录

致谢

原创性声明