TLR2，4基因SNP分析及TLR4基因3'非编码区SNP功能研究

摘要

1.研究背景和目的 鼻咽癌是一种源自鼻咽部的上皮细胞癌，在中国华南地区高发，故鼻咽癌素有“广东癌”之称。鼻咽癌的发生与许多因素有关，例如遗传，环境因子，EB病毒的感染以及这三者之间的交互作用。大量的流行病学研究告诉我们鼻咽癌的高发家系遵循孟德尔单基因遗传传递模式，但这仅是少量高外显率的低频遗传易感基因作用的结果。大部分鼻咽癌的发生为散发(90％以上)，绝大多数遵循多基因一环境交互作用的模式，这些基因往往具有低外显率。近年来对鼻咽癌的研究，则是从特定基因的变异着手，因此在鼻咽癌细胞中，癌基因(oncogene)和抑癌基因(tumor suppressor gene)的多态性亦被分析并寻找其与鼻咽癌发生的关联性。 EB病毒是目前公认与鼻咽癌发生有关的因子。Old LJ最早发现，来自鼻咽癌病人的血清能够与受到EB病毒感染的细胞发生免疫反应。后续对于EB病毒与鼻咽癌的研究就此展开。人们发现：在人类的口咽上皮细胞上有类似于B细胞的EB病毒受体，C3d受体；EB病毒可能在鼻咽癌发生的初期即己感染上皮细胞；此外，在鼻咽癌病人血中则是发现游离EB病毒的DNA。这些研究不但证明了EB病毒与鼻咽癌的相关性，同时也提供了临床检测鼻咽癌的方法。 Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)家族是天然免疫系统中的主要模式识别受体(patem recognitionreceptor，PRR)。所识别的配体大多数都归类为病原相关模式分子(pathogen associated molecular pattem，PAMP)。目前已有10个成员(TLRl-10)，其中Toll-like receptor 2(TLR2)是负责革兰氏阳性菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)及螺旋体的膜脂蛋白(1ipoprotein)感染，而TLR4则为辨认革兰氏阴性菌的脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)刺激的受体。大量研究表明TLRs通过识别不同病原体的PAMP，激活先天性免疫系统产生促炎症因子、抗微生物肽，抵御病原微生物入侵；同时，向抗原递呈细胞发出警报，释放炎性细胞因子和共刺激因子，在先天性免疫防御中起重要作用，并最终启动细胞和体液两种适应性免疫反应。鉴于TLRs作为连接先天性免疫与适应性免疫的关键环节发挥着极为重要的作用，其多态性和疾病易感性或耐受性的关系也引起人们的极大兴趣。 肿瘤免疫治疗的关键是如何诱导和激活机体的抗肿瘤免疫应答。新近的研究发现TLRs所介导的信号传导在机体抗肿瘤免疫应答过程当中起到相当重要的作用。目前关于TLR受体家族基因多态性与鼻咽癌的报道不多，尚未见中国人TLR2，4基因突变与鼻咽癌相关性的研究。为此我们通过PCR一直接测序的方法筛查TLR2，4基因，看看是否存在与鼻咽癌相关联的单核苷酸多态性(Single-Nucleotide Polymorphism，SNP)，并对有关联意义的SNP进行功能研究，旨在为揭示鼻咽癌发病易感性的分子基础提供实验依据。 2．研究方法 本研究首先以24份散发鼻咽癌样本为模板进行PCR扩增，引物设计覆盖TLR2，4基因所有重要功能区域。扩增产物经直接测序后，读解序列，筛选出合适的SNPs。进一步用486份鼻咽癌患者和529份正常人标本进行了一个广州方言人群基础上的病例一对照研究，患者与正常人血样本均来源于南海、佛山、顺德、清远、四会、罗定等鼻咽癌高发区。并且利用双荧光报告基因系统来研究有意义的SNP。在研究中，PCR扩增采用多重PCR和单一PCR相结合的方法，大大节省了DNA样本。引物设计用在线PRIMER 3.0软件。所有PCR反应均在PE9700PCR扩增仪上进行，产物用酶解纯化后在ABI377测序仪上测序，SNP分型采用了直接测序法。序列读解采用Phred／Phrap／consed软件包、DNAStar／Seqman和Chromas软件。数据分析采用SPSSll.0统计软件，P值小于0.05视为有统计学差异。功能研究采用Promega公司推出的第三代荧光报告基因转录调控研究系统pGL-3系统，试剂和检测设备均为该系统推荐产品，保证了结果的可靠性。 3．结果 1、在TLR2的变异筛选中，并未发现单核苷酸多态性(SNP)位点，说 明TLR2在鼻咽癌中高度保守；在TLR4的变异筛选中，发现了两个 SNP(Gll350C、Cll449T)，国内外首次报道。 2、对这两个SNP在鼻咽癌患者和健康广府人中分型，发现TLR4的 G11350C变异是一个鼻咽癌发病危险因素(p=0.002，OR=2.21，95％ CI=1.34—3.64)。而TLR4的C11449T变异与鼻咽癌的关系没有统计 学意义(p>0.05)。 3、当按照年龄≤47岁，>47岁分层后，可以看到这种危险性在低年龄组 更明显，OR值=2.71(P=0.001)。按性别分层后，男性的鼻咽癌患 病风险增加，OR值2.30(P=0.006)。 4、将TLR4的3'UTR全长构建入萤火虫报告基因载体pGL3-Promoter。 分别构建了突变型和野生型。 5、利用双荧光报告基因系统在对照组中分析了突变型在鼻咽癌细胞 C666中与野生型的表达差异，结果显示突变型的荧光相对比值要低于 野生型，且两者都远低于阳性对照(p<0.05)，转染后60小时这种差异 更明显，突变型比野生型低了40％。 4．结论 在TLR4的3'UTR鉴定出2个新的SNP并进一步确定其中的11350C变异与NPC发病风险相关。并且11350C变异可以影响荧光素酶基因的表达，提示TLR4的3’UTR点突变可能影响TLR4的mRNA稳定性，使TLR4表达下调，造成EBV感染后的抗病毒免疫缺陷。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

前言

1.鼻咽癌概论

2.鼻咽癌易感基因的研究的一般策略

3.TOLL样受体与免疫

4.本研究的目的和意义

实验一广州方言人群中TLR2和TLR4基因单核苷酸多态性分析及其意义

材料与方法

结果

讨论

实验二广州方言人群中TLR4基因3’非编码区SNP发生频率及基因分型

材料与方法（同实验一）

结果

讨论

实验三TLR4基因3’非编码区生物学意义

材料与方法

结果

讨论

结语

参考文献

附录1 3’端非翻译区的功能与肿瘤发病风险的关系·综述

附录2 pGL3/TLR4-3’UTR野生型和突变型测序结果

附录3本研究所用的引物序列

附录4本研究中所使用的工具网站一览

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