阴道毛滴虫的毒力分析及其精氨酸脱亚氨基酶的研究

摘要

本论文采用和比较不同的毛滴虫毒力分析方法，并对精氨酸脱亚氨基酶基因及其可能的起源进行研究。 毛滴虫含有多种半胱氨酸蛋白酶(cysteineproteinase，CP)，其中一些已被鉴定为毒力因子。使用复性电泳方法建立实验室8株毛滴虫的蛋白酶降解图谱，虫株的酶谱总体上较为一致，具活性的蛋白酶分子量在23kDa到110kDa之间，条带清晰的可达11条。TLCK和E-64能抑制其降解活性，表明这些酶属于半胱氨酸蛋白酶家族。GZTv15的CP活性特别高，酶谱带型也比较特别。结合蛋白SDS-PAGE图谱，认为毛滴虫的CPs占总蛋白的比例并不大，但其活性很高，对毛滴虫寄生生活有着重要意义。 毒力分析的方法包括建立毛滴虫小鼠模型，以及体外溶血和上皮细胞毒实验。毛滴虫对T84的细胞毒力作用没有获得可靠的量化结果。统计分析表明毛滴虫引起的脓肿、溶血及其甲硝唑抗性之间不存在显著相关性。但是脓肿和MLC的P值为0.057，反映毛滴虫对小鼠的毒力可能与抗药性之间存在相关性。分析结果为深入研究体内因子对毛滴虫毒力的影响提供了有价值的参考资料。 精氨酸水解途径参与毛滴虫的致病毒力作用，对其生长和提高在阴道寄生的适应性有着重要的意义，但催化该途径第一步反应的精氨酸脱亚氨基酶(argininedeiminase,ADI)的基因迄今未见报道。根据ADI氨基酸保守区EGGD和MHLD，设计引物扩增毛滴虫的ADI。扩增片段经测序后在TIGR的毛滴虫基因组数据库作检索到氨基酸序列一致的编号为96185的蛋白。BLAST和同源结构域分析都表明该蛋白很可能是ADI。运用分析软件，将A92185与其它生物的ADI进行序列比对，并构建树状聚类图，结果显示毛滴虫A92185与贾第鞭毛虫ADI的相似度最高，但与支原体及其它细菌相似性较低。 将阴道毛滴虫A92185基因克隆于His融合表达载体pET-28a(+)构建成表达质粒pET-A92185。大肠杆菌BL21在转化pET-A92185后经IPTG诱导成功表达了His-A92185融合蛋白，分子量约46kDa。当菌液OD600值为0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG在28℃诱导3小时，目的蛋白产量很高，以无活性的形式形成包涵体。表达的蛋白为今后鉴定ADI酶活性做准备。

目录

文摘

英文文摘

第1章前言

第2章材料与方法

第3章实验结果和分析

第4章讨论

参考文献

缩略词

附录

致谢

原创性声明