Mic和Amic的冠突伪尾柱虫的差异表达基因的克隆和功能研究

摘要

纤毛虫大核和小核的分化，正如高等动物有体细胞和生殖细胞分化一样，二者在本质上十分相似。近二十年来，本实验室对多种腹毛类纤毛虫有小核细胞(Micronucleates，Mic)和无小核细胞(Amicronucleates，Amic)的比较研究证明，它们的小核都具有明显的体功能，尽管其表现形式不尽相同。这些研究结果无疑突破了传统的大、小核分工理念，为小核的体功能积累了大量细胞学证据。那么，小核体功能的遗传机理是什么?两种细胞系不同生长、发育阶段的基因表达谱有何差异?相关差异表达基因的结构与功能如何?带着这些问题，在详细综述国内外的研究现状和前人工作的基础上，本论文从细胞学和分子遗传学两个方面分四部分展开了研究。 第一部分、对冠突伪尾柱虫Mic细胞和Amic进行了细胞学研究。采用横向切割方法建立多个Amic细胞系，通过蛋白银染色技术和激光共聚焦技术验证了Amic细胞AZM缺损的表型与获得Amic细胞系的切割方法无关。同时，前人关于“AZM小膜结构缺损产生于分裂间期，但通过新一轮的形态发生，其AZM又能得到恢复”的结论被再次获得证实。放线菌素D是基因转录的抑制剂，用其处理冠突伪尾柱虫Amic间期细胞，能大大降低AZM的缺损率。据此推测，Amic细胞AZM结构的不稳定性很可能与两种细胞系间存在基因表达差异有关。 第二部分、对冠突伪尾柱虫Mic细胞系和Amic细胞系在无性繁殖周期的三个应激条件下的差异表达基因进行了克隆和鉴定。利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建三个正向消减文库和一个反向消减文库，对其中1030个克隆进行了筛选，对所得107个阳性克隆进行了序列分析，共获得65个可能参与纤毛虫细胞分化与发育、信号转导、转录、细胞周期调控、胁迫应答和细胞结构相关的EST。同时，利用实时半定量荧光PCR对代表性阳性克隆在两细胞系的表达差异进行了相对定量分析。结果表明：Mic细胞系和Amic细胞系在相同的应激条件下呈现明显的表达差异，序列分析的结果暗示：小核的失去可能导致细胞钙信号转导紊乱，细胞胁迫响应能力下降，为第一部分的细胞形态学研究结果提供了分子遗传机理方面的佐证。 第三部分、在前人细胞学观察的基础上，对冠突伪尾柱虫Mic细胞系和Amic细胞系在接合生殖阶段差异表达的基因进行了克隆和鉴定。利用SSH技术构建了一个正向消减文库，对其中80个克隆进行了筛选，对32个阳性克隆进行了序列分析，共鉴定出23个差异表达的EST，它们分别与RNA干涉、DNA复制与修复、细胞信号转导、基因表达与调控以及胁迫应答有关。同时，利用实时半定量荧光PCR对8个代表性阳性克隆在Mic×Mic与Amic×Amic两种交配组合的表达差异进行了相对定量分析。结果表明，Mic×Mic与Amic×Amic两种交配组合在第一次皮膜改组之前存在明显的基因表达差异。据此本文提出假设，认为Amic×Amic第一次形态发生事件出现异常与失去小核进而引发一系列基因表达负调控因子的丧失有关。 第四部分、利用RACE技术和Mac-end-Mac技术对两种细胞系有性和无性生活周期中代表性差异表达基因的全长进行了克隆和功能分析。 1.克隆了在无性生活周期存在明显表达差异的Y180的全长大核基因和cDNA。生物信息学分析提示，这一新基因可能在细胞生长、胞外分泌及细胞信号转导方面具有重要功能。利用RNAi喂饲技术对该基因的功能进行初步鉴定表明，其mRNA表达受到抑制后，细胞皮层结构发生错误排列，大核在整个细胞质的空间位置，数目和形态发生明显变化。 2.克隆了HSP70和HSP90全长大核基因以及HSP90全长cDNA序列。生物学信息学分析表明，所克隆的HSP90定位于细胞质，HSP70定位于内质网。间接免疫荧光技术观察表明，HSP70参与了冠突伪尾柱虫纤毛器和其它微管胞器的构成。通过高温诱导HSP70和HSP90表达，Amic细胞培养群体中口器缺损率明显下降。结合前人的相关研究结果，本文提出假设认为，HSP70可能通过内质网应激和微管修复机制参与Amic细胞缺损口器的修复。 3.克隆了Mic细胞系有性生活周期上调表达幅度最大的PPD的全长大核基因，并利用RNAi喂饲技术验证了PPD蛋白在冠突伪尾柱虫大核发育过程中的功能。结果提示，小核可能通过PPD蛋白参与的RNAi机制来指导新大核的发生。对PPD进行系统发育分析的结果显示，参与RNAi的piwi相关基因可能从纤毛虫和后生动物的共同祖先进化而来。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

第二章冠突伪尾柱虫Amic细胞系无性世代的细胞学研究

第三章Mic和Amic细胞系在无性世代再生期、饥饿期和静止期差异表达基因的克隆与鉴定

第四章Mic和Amic细胞系接合生殖期间差异表达基因的克隆与鉴定

第五章Y180的全长cDNA和大核基因的克隆及功能的初步研究

第六章冠突伪尾柱虫HSP70和HSP90全长大核基因的克隆、系统发育和功能分析

第七章冠突伪尾柱虫PPD蛋白全长大核基因的克隆、系统发育和功能分析

结论与展望

参考文献

缩略词表

附录

致 谢

论文原创性声明