凡纳滨对虾白斑综合症病毒感染相关基因的克隆与功能研究

摘要

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，Boone,1931)，又名南美白对虾，属节肢动物门(Arthropodal)、甲壳纲(Crnstacca)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、对虾科(Penaeidae)、滨对虾属(Litopenaeus)，是一种广温广盐性的热带海产虾类，具有生长速度快，营养需求低，对养殖环境的适应性强，虾体壳薄、含肉率高、肉味鲜美、经济价值高等优点，是当今世界养殖虾类产量最高的三大品种之一，也是我国对虾养殖区的主要养殖品种。目前，凡纳滨对虾在我国不论是海水，还是淡水养殖都取得了较大的发展，已经成为水产养殖业的热点。但是，随着对虾养殖业的大力发展，养殖面积和规模的不断扩大，流行性病害也日益猖獗。对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是导致世界范围内养殖对虾暴发性传染病的病毒，是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。由于WSSV传播迅速，致死率高，危害性大，给对虾养殖业造成了巨大的经济损失。因此，对虾养殖生产上迫切需要对包括白斑病在内的各种疾病的防治对策，而提高对虾的自身免疫力，增强其机体防御机能是综合防治的根本措施之一。 本研究以对WSSV不同抗性的凡纳滨对虾为对象，应用抑制性消减杂交等技术，构建了凡纳滨对虾在WSSV感染前后的差异表达基因消减文库4个，其中2个正向库(在病毒未感染和感染后48h，以抗性家系为Tester，敏感家系为Drivel)和2个反向库(在病毒未感染和感染后48h，以敏感家系为Tester，抗性家系为Drivel)。通过对文库克隆的随机测序和生物信息学分析，所获得的1049条有效ESTs被聚成193个基因簇(cluster)，其中，有132个基因簇包括两个以上的ESTs序列(contig)，61个基因簇为单一序列(singleton)。与NCBI非冗余蛋白质和核酸数据库进行BLAST比对，在获得的序列当中，有62％的序列与已知的基因序列具有高度的同源性(E value<10<'-5>)，其中有532条ESTs在正向库中，118条ESTs在反向库中，而38％则无相似性。根据同源性中已知功能的蛋白基因，将基因簇主要分成9大类：免疫相关的蛋白质和酶，信号调节和转导相关因子，凋亡相关蛋白，抗氧化酶，转运蛋白，核糖体蛋白，转录和翻译相关的因子，代谢相关的因子以及其它。其中，免疫相关的蛋白和酶基因类，其成员最多，占到了总基因簇的一半以上。从中筛选鉴定了40多个差异表达的基因，其中有5个基因片段(1accase，carboxypeptidase B，H<'+>-transporting ATP synthase，Acyl-ConAbinding protein(ACBP)， cortical granule protein with LDL-receptor)是在对虾中首次获得，均已递交GenBank登记。此外，血蓝蛋白(haemocyanin)和组织蛋白酶(cathepsin L)ESTs在两个正向库中出现频率最高，分别为274条和54条。 在序列同源性分析中，发现了2个lectin样ESTs序列：一个长400bp具有C-tyPe lectin(CTL结构，另一个长403bp与斑节对虾的lectin PmAV，同源性较高。为了研究这两个片段所在基因的功能，采用RACE技术克隆了这两个凝集素基因的全长cDNA，分别将它们命名为Lvlectin4E(长637bp)和Lvlectin5D(长678bp)。ORF预测和氨基酸序列分析表明，这两个凝集素新基因都是属于C型凝集素，两者均有C-type lectin的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain，CRDs)，有保守的半胱氨酸，二硫键和EPN或QPN特征。此外，RT-PCR方法对这两个基因表达情况进行分析发现，Lvlectin4E在肝胰腺、血细胞、鳃、肠、肌肉、脑、盲囊、神经、精管、胃等组织中均有表达，特别在肝胰腺、胃、肠、精管中表达量最高，在眼中可以检测到其微量的表达，但在心脏组织中，则没有检测到。Lvlectin5D在肝、胃中有较高的表达量，在鳃中有很微量的表达，而在其它组织中则没有检测到。 利用基因工程手段，将这两个基因ORF分别插入到表达质粒pQE30中，构建了Lvlectin4E和Lvlectin5D基因重组原核表达载体(pQE30／Lvlectin 4E和pQE30／Lvlectin5D)，并进行转化和诱导表达，经SDS-PAGE和蛋白免疫印迹进行检测分析，发现Lvlectin4E和Lvlectin5D基因的表达产物均分别出现了明显的特异性条带，其融合表达产物的大小与预测的一致，进一步用Ni-NTA亲和层析柱将重组蛋白纯化，获得了高含量高纯度的目的蛋白，再利用分步透析进行了纯化蛋白的成功复性。同时纯化了一个空载pET32a表达的对照蛋白。用重组蛋白作为抗原免疫小白鼠，制备抗融合蛋白的血清，并进一步进行理化分析表明，两个重组蛋白对鱼、兔子、小鼠及鸡等脊椎动物血细胞均具有凝集活性，而且这种凝血活性可被D-果糖、D-半乳糖、乳糖、D-甘露糖和D-葡萄糖和EDTA所抑制；而Ca<‘2+>则对其凝血活性具有促进的作用。两者均能促进PO活性的提高。点杂交结果显示，Lvlectin4E和Lvlectin5D重组蛋白对WSSV表现出特异的亲和力，其中Lvlectin4E比Lvlectin5D的亲和作用更强。 通过在对虾原代细胞和活体实验表明，两个重组蛋白具有一定的抗病毒作用。用WSSV浓度为10<'-3>感染凡纳滨对虾原代培养细胞3d后，对照组中被感染细胞有少量死亡，也有少量的碎片出现，而Lvlectin4E重组蛋白与WSSV孵育后感染的仍无细胞死亡，但Lvlectin5D重组蛋白处理组也出现少量死亡；5d后，对照组中感染的细胞大量死亡，细胞碎片堆增大，而Lvlectin4E重组蛋白与WSSV孵育后感染的只有少量细胞死亡，Lvlectin5D重组蛋白处理组也出现较多细胞聚集成堆，部分细胞死亡，但比对照组明显的少，而且出现死亡的时间也相对晚。在对虾活体中进行重组蛋白保护试验结果显示，Lvlectin4E和Lvlectin5D与WSSV孵育后注射对虾均能推迟对虾发病时间，在对照组已发病全部死亡时，处理组还有70％存活，达到显著差异；WSSV感染11天后保护率分别达到57％和43％。但是，先注射WSSV后注射重组蛋白，或先注射重组蛋白后注射WSSV，均与对照组死亡率没有明显的差别。

目录

文摘

英文文摘

第1章 文献综述

1.1 对虾养殖与病害防治研究进展

1.1.1 对虾养殖与凡纳滨对虾概况

1.1.2 白斑综合症病毒及其防治研究进展

1.2 虾类免疫系统及虾病免疫学防治研究进展

1.2.1 虾类的免疫系统

1.2.2 虾类免疫应答机制

1.2.3 对虾病害的免疫防治研究

1.3 抑制性消减杂交技术的发展及其在对虾功能基因研究中的应用

1.3.1 抑制性消减杂交技术的发展

1.3.2 抑制性消减杂交技术的基本原理和技术流程

1.3.3 抑制消减杂交技术在虾类功能基因研究中的应用

1.3.4 展望

1.4 本研究的目的和意义

第2章 凡纳滨对虾与白斑综合症病毒感染相关基因差异表达文库的构建及EST分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.2.1 RNA提取结果

2.2.2 SMART cDNA的合成与RsaI酶切

2.2.3抑制消减杂交效果验证

2.2.4消减cDNA文库中插入片段大小的检测

2.2.5序列测定与生物信息学分析

2.2.6半定量RT-PCR分析结果

2.3讨论

2.4小结

第3章C型凝集素基因Lvlectin4E和Lvlectin 5D全长cDNA克隆及序列分析

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.2.1 5',3'RACE结果

3.2.2Lvlectin4E和Lvlectin5D cDNA全长序列

3.2.3Lvlectin4E和Lvlectin5D基因的氨基酸序列特征

3.2.4Lvlectin4E和Lvlectin5D氨基酸序的CRDs预测

3.2.5Lvlectin4E和Lvlectin5D信号肽预测

3.2.615种无脊椎动物C型凝集素蛋白的同源性分析及进化关系

3.2.7Lvlectin4E和Lvlectin5在凡纳滨对虾组织中的分布

3.3讨论

3.4小结

第4章C型凝集素Lvlectin 4E和Lvlectin 5D重组原核表达与纯化

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.2.1Lvlectin 4E和Lvlectin 5D ORF PCR扩增

4.2.2重组质粒酶切鉴定

4.2.3重组质粒的菌落PCR鉴定

4.2.4重组质粒的目的序列测定

4.2.5重组表达蛋白的SDS-PAGE检测

4.2.6重组表达蛋白的Western blot检测

4.2.7重组表达蛋白的纯化

4.2.8重组表达蛋白复性及浓度测定

4.3讨论

4.4小结

第5章C-型凝集素Lvlectin4E和Lvlectin5D重组蛋白理化性质分析

5.1材料与方法

5.2果与分析

5.2.1重组蛋白的凝血活性

5.2.2重组蛋白对健康和WSSV感染对虾血细胞的凝集活性

5.2.3重组蛋白对健康虾原代培养血细胞的凝集活性

5.2.4糖结合抑制活性试验结果

5.2.5EDTA及金属离子抑制活性试验

5.2.6重组蛋白粘附WSSV的活性

5.2.7重组蛋白与酚氧化酶活性的关系

5.3讨论

5.4小结

第6章C型凝集素Lvlectin4E和Lvlectin5D重组蛋白抗WSSV作用的初步研究

6.1材料与方法

6.2结果与分析

6.2.1重组蛋白毒性试验结果

6.2.2WSSV感染对虾原代培养血细胞结果

6.2.3重组蛋白抗WSSV感染试验结果

6.3讨论

6.4小结

论文总结

参考文献

附录

缩写词

攻读博士学位期间发表及待发表的论文

致谢

原创性声明