切应力调控内皮祖细胞功能的基础和临床应用研究

摘要

动脉粥样硬化所造成的冠状动脉和外周血管疾病是严重危害人类健康的主要原因。血管内皮结构和功能损伤是动脉粥样硬化血管疾病的始动环节，修复血管内皮损伤是防治动脉粥样硬化血管疾病的重要措施。近来研究表明，骨髓、外周血和脐血中存在内皮细胞的前体细胞．内皮祖细胞(Endothelial progenitorcells，EPCs)。与成熟的内皮细胞相比，内皮祖细胞具有以下特点：(1)原位分化增殖能力极强；(2)粘附和贴壁能力强；(3)体外扩增培养速度快，且容易获得。内皮祖细胞能加快损伤血管再内皮化，抑制病理性新生内膜形成，参与血管内皮损伤的修复过程。而在多种血管疾病危险因素存在和动脉粥样硬化血管疾病发生时，循环内皮祖细胞数量和功能下降，并且与内皮依赖舒张功能的减退密切相关。所以，内皮祖细胞是修复动脉粥样硬化血管内皮损伤的理想种子细胞。 研究表明，在血管内皮损伤发生后，内皮祖细胞能归巢至损伤血管部位，在局部发挥抗血栓特性、迁移增殖功能和抗氧化活性，参与血管内皮损伤的修复过程。组织纤溶酶原激活物(Tissue-type plasminogen activator，t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂(Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和前列环素(ProstaglandinI<,2>，PGI<,2>)是调节内皮祖细胞抗血栓活性的重要物质。t-PA是内皮祖细胞合成的主要抗血栓物质之一，对于内皮祖细胞维持抗血栓功能，防止局部血栓形成以及继发的缺血性血管疾病具有重要的意义。PAI-1是内皮祖细胞合成的对抗t-PA抗血栓作用的物质，PGI<,2>是前列腺素代谢途径中的重要产物，具有抑制血小板聚集的作用。PGI<,2>很不稳定，常转化为无活性的代谢产物6-keto-PGF1 α。由于切应力调控内皮祖细胞功能的基础和临床应用研究6-keto-PGF1 α性质较为稳定，常作为检测PGI<,2>的替代指标。内皮祖细胞分泌t-PA和PGI<,2>增多，PAI-1水平减少有利于防止损伤血管内皮局部的血栓形成。内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是调节内皮祖细胞功能的重要功能蛋白，能催化L-精氨酸产生一氧化氮(Nitric oxide，NO)，调节内皮祖细胞的迁移和增殖等功能，在其修复血管内皮损伤的过程中起着重要的作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)主要调节内皮祖细胞的抗氧化及抗细胞凋亡能力，可以清除氧自由基和其他氧化物质，并减少NO的灭活。其中，Cu/Zn-SOD是机体内SOD的主要类型，通过检测Cu/Zn-SOD可大致反映总的SOD活性。因此，t-PA、eNOS和SOD是介导内皮祖细胞抗血栓特性、迁移增殖功能和抗氧化活性的重要物质。通过寻找理想的理化及分子生物学方法，上调内皮祖细胞t-PA、eNOS和SOD的基因表达，是以细胞疗法为基础防治动脉粥样硬化血管疾病内皮损伤的重要手段。 血管生物学研究表明，切应力可作用于血管内皮细胞，引起内皮细胞结构和功能的适应性改变，是一种非常重要的内皮功能调节因素。目前，研究发现提高切应力能增加成熟内皮细胞t-PA、eNOS和SOD的表达，但有关切应力对内皮祖细胞t-PA、eNOS和SOD的调节作用尚不清楚。因此，本研究构建内皮祖细胞体外培养模型，观察体外切应力对内皮祖细胞t-PA、eNOS和Cu/Zn-SOD基因表达的影响，分析不同体外切应力下内皮祖细胞分泌t-PA、PAI-1和PGI<,2>等抗血栓物质、产生NO以及Cu/Zn-SOD活性的变化，进一步探讨流体切应力对内皮祖细胞功能活性的调节作用；构建小径人工血管在体移植动物模型，观察体外切应力处理内皮祖细胞对小径人工血管在体移植模型内皮化和通畅率的影响。 运动锻炼通过提高在体血流切应力，可以保护血管内皮功能，促进心血管健康和预防心血管疾病。近来研究发现运动可以增加冠心病和和外周缺血性血管疾病患者内皮祖细胞数量和功能，提示运动对内皮祖细胞的调节可能是其改善内皮功能的作用机制之一。然而，有关运动对健康成人循环内皮祖细胞数量和功能的影响及其机制尚不完全清楚。由于NO、血管内皮生长因子fVascular endothelialgrowth factor，VEGF)和粒一巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)是调节内皮祖细胞数量和功能的重要物质，我们假设运动能上调健康成人循环内皮祖细胞数量和功能，并且其作用可能与NO、切应力调控内皮祖细胞功能的基础和临床应用研究VEGF和GM-CSF有关。因此，本文采用急性运动研究模型，以流式细胞法和细胞培养荧光标记法等方法观察健康人循环内皮祖细胞的数量，检测内皮祖细胞的黏附、迁移和增殖能力，测定血浆和内皮祖细胞分泌NO、VEGF和GM-CSF水平，并分析运动调节健康成人循环内皮祖细胞NO、VEGF和GM-CSF之间的可能联系，以探讨运动对健康成人循环内皮祖细胞的调节机制。本研究包括四个部分： 第一部分 内皮祖细胞体外培养模型的构建 目的：体外诱导外周血单个核细胞分化为内皮祖细胞，探讨内皮祖细胞的适宜生长条件，构建外周血内皮祖细胞的体外培养模型。 结论：体外诱导外周血单个核细胞分化为内皮祖细胞取材方便，简便易行，可作为构建内皮祖细胞体外培养模型的理想途径。其中，VEGF和Fn对内皮祖细胞的体外诱导分化生长起着重要的作用。 第二部分体 外切应力处理对内皮祖细胞功能的调节 目的：观察体外切应力对内皮祖细胞t-PA、eNOS和Cu/Zn-SOD基因表达的影响，分析不同体外切应力下内皮祖细胞分泌t-PA、PAI-1和PGI<,2>等抗血栓物质、产生NO以及Cu/Zn-SOD活性的变化，探讨流体切应力对内皮祖细胞功能活性的调节作用。 结论：体外切应力能上调内皮祖细胞t-PA的基因表达，促进内皮祖细胞t-PA分泌，抑制PAI-1分泌，促进内皮祖细胞分泌PGI<,2>，改善内皮祖细胞抗血栓能力；上调内皮祖细胞eNOS基因表达，促进内皮祖细胞NO分泌，有助于改善其迁移增殖功能；上调内皮祖细胞Cu/Zn-SOD基因表达，增强内皮祖细胞Cu/Zn-SOD活性，提高内皮祖细胞的抗氧化活性。因此，在生理范围内增加体外切应力，能上调内皮祖细胞的功能活性，是提高内皮祖细胞修复血管内皮损伤能力的重要策略。 第三部分 体外切应力处理内皮祖细胞对小径人工血管在体移植模型的影响 目的：研究体外切应力处理内皮祖细胞对小径人工血管在体移植模型内皮化和通畅率的影响，通过在体模型进一步探讨体外切应力对内皮祖细胞功能的调节作用。 结论：切应力处理内皮祖细胞能加速小径人工血管在体移植模型的内皮化，改善人工血管移植通畅率，这种作用可能与切应力处理促进内皮祖细胞NO分泌，增强其迁移和增殖功能，并增加内皮祖细胞分泌t-PA、PAI-1和：PGI<,2>等抗血栓物质，增强其抗血栓能力有关。 第四部分 运动对健康成人循环内皮祖细胞数量和功能的调节及其机制 目的：采用急性运动研究模型，观察运动对健康成人循环内皮祖细胞数量和功能的影响，探讨运动对循环内皮祖细胞可能的调节机制。 结论：急性运动不仅能迅速增加健康成人循环内皮祖细胞数量，还能上调循环内皮祖细胞的迁移和增殖功能，这种作用与其诱导NO释放增多有关。但是，急性运动上调健康成人循环内皮祖细胞数量和功能的维持时间较为短暂，其机制可能与急性运动后血浆NO水平的下降有关，提示可能需要长期运动锻炼以维持对健康成人循环内皮祖细胞数量和功能的上调作用。因此，运动能上调健康成人循环内皮祖细胞的数量和功能，表明提高在体血流切应力是增加内源性血管内皮损伤修复能力的重要手段。 总之，本研究表明，体外切应力处理可以上调内皮祖细胞功能基因的表达，改善内皮祖细胞的功能活性，加速内皮祖细胞衬里小径人工血管在体移植模型的内皮化，改善人工血管移植通畅率。运动作为提高在体血流切应力的重要方式，能上调健康成人循环内皮祖细胞的数量和功能，并且这种作用与血浆NO水平增加密切相关。因此，流体动力学的调节包括体外切应力处理和运动增加在体血流切应力，可作为提高内皮祖细胞修复血管内皮损伤能力的重要策略。

目录

文摘

英文文摘

第一部分内皮祖细胞体外培养模型的构建

第一章 前言

第二章 实验材料

第三章 实验方法

第四章 实验结果

第五章 讨论

第六章 小结

参考文献

第二部分体外切应力对内皮祖细胞功能的调节

第一章前言

第二章 实验材料

第三章实验方法

第四章实验结果

第五章 讨论

第六章小结

参考文献

第三部分体外切应力处理内皮祖细胞对小径人工血管在体移植模型的影响

第一章前言

第二章实验材料

第三章实验方法

第四章实验结果

第五章讨论

第六章小结

参考文献

第四部分运动对循环内皮祖细胞数量和功能的调节及其机制

第一章前言

第二章实验材料

第三章实验方法

第四章实验结果

第五章讨论

第六章小结

参考文献

附 表

附 图(1)

附 图(2)

附 图(3)

附 录

致 谢