Survivin、Livin在Ⅱ期大肠癌中的表达及siRNA抑制HT-29中Livin基因表达的研究

摘要

第一部分、利用免疫组化SP法检测了Survivin和Livin在Dukes’B期结直肠癌中的表达，着重探讨了Survivin、Livin和患者临床特征和生存的关系。 1、研究目的： 1.1 探讨Dukes’B期结直肠癌组织中Survivin和Livin的表达情况。 1.2 探讨Dukes’B期结直肠癌根治术后的高危复发因素；分析Survivin、Livin与Dukes’B期结直肠癌患者临床特征及预后的关系。 2、研究方法： 2.1收集1998年1月至1999年12月中山大学肿瘤防治中心初治Dukes’B期结直肠癌患者术后组织标本共81例，所有患者均行根治性手术，术后定期随访。所有患者均经术后临床病理分期为Dukes’B期。12例正常对照标本取自经病理证实无肿瘤残留的阴性切缘。 2.2免疫组化SP法检测81例Dukes’B期结直肠癌组织及12例正常对照组织中Slarvivin和Livin的表达。 2.3利用统计学软件SPSS13.0分析两种蛋白表达的相关性、与患者临床特征的关系、与患者术后复发/转移和生存的关系。 3、研究结果： 3.1在12例正常结直肠粘膜组织中仅1例检测到Survivin蛋白弱阳性表达，2例Livin蛋白呈弱阳性表达。在8l例Dukes’B期结直肠癌组织中，Survivin的阳性表达率为58.0﹪(47/81)，Survivin主要表达于肿瘤细胞胞浆，胞核和胞膜也有轻度染色；Livin的阳性表达率为45.7﹪(37/81)，其中弱阳性表达率为8.6﹪(7/81)，中度阳性表达率为13.6﹪(11/81)，强阳性表达率为23.5﹪(19/81)，Livin在肿瘤细胞细胞核及细胞浆中均有表达。Survivin、Livin在结直肠癌组织及正常结直肠粘膜中的表达差异具有统计学意义(均P<0.05)3.2 Survivin及Livin在：Dukes’B期结直肠癌组织中的表达与性别、肿瘤部位、肿瘤大小、T分期、大体类型、组织分化程度均无明显相关性(均P>0.05)；Survivin的表达与患者年龄有关，<50岁患者阳性率更高(P=0.003)；Survivin和Livin在有复发和/或转移患者中的表达较无复发和/或转移患者中的表达高，差异均有显著性意义(P值分别为0.02和0.001)。 Livin和Survivin的表达不具相关性(P>0.05)。 3.3 Survivin阳性和阴性组的5年牛存率分别为63.8﹪和88.2﹪，log-rank检验显示有显著性差异(P=0.039)；Livin阳性和阴性组的5年牛存率分别为56.8﹪和90.9﹪，log-rank检验亦显示有显著性差异(P=0.001)； Survivin阳性和阴性组的5年无复发生存率分别61.7﹪和85.3﹪，log-rank检验显示有显著性差异(P=0.032)；Livin阳性和阴性组的5年无复发生存率分别为54.1﹪和86.4﹪，log-rank检验亦显示有显著性差异(P=0.002)。Cox多因素相关分析发现T4(P=0.002)及Livin阳性(P=0.047)是Dukes’B期结直肠癌的独立不良预后因素。 4、结论： 4.1 Survivin与LiVin在Dukes’B期结直肠癌组织中表达明显高于正常对照，两者的表达不具相关性。 4.2 Survivin和Livin阳性表达患者更易复发/转移，生存期更短。 4.3 Cox多素分析显示T4和Livin表达，而非Survivin表达为Dukes’B期结直肠癌的独立不良预后因素，提示Livin基因可能在早期结直肠癌发病中较Survivin起更大作用。 第二部分 siRNA抑制HT-29细胞中Livin基因表达的实验研究。 1 研究目的： 1.1筛选出有效抑制Livin基因表达的siRNA片断。 1.2观察siRNA抑制人结肠癌细胞系HT-29 Livin基因表达后对其生物学行为的影响。 2 研究方法： 2.1按照siRNA的合成原则，设计两对siRNA分子，由上海吉玛公司合成，分别称为siRNA-648和siRNA-1273，合成后在Genebank中进行BLAST，排除与其他基因同源。利用转染试剂RNAi-mate分别转染入HT-29细胞。 2.2在mRNA水平和蛋白质水平分别检测siRNA转染后对HT-29细胞中Livin基因的抑制作用，筛选有效的序列进行下一步实验。观察siRNA不同时间点和不同浓度对Livin的抑制作用。 2.3 siRNA转染后对HT-29细胞生物学行为的影响：采用流式细胞仪测定转染siRNA分子48h后HT-29细胞凋亡率和细胞周期的变化；测定转染后48h Caspase-3活性的变化；利用MTT法测定siRNA与常用治疗肠癌药物5-FU、CPT-11、Oxaliplatin共同作用对HT-29细胞半数抑制浓度(IC<,50>)的影响，计算增敏倍数。 2.4将HT-29细胞与CPT-11、5-FU、Oxaliplatin共孵48h，了解对Livin基因表达是否有影响，初步探讨siRNA和化疗药物协同作用的机制。 3 研究结果： 3.1 RNAi-mate可有效地将siRNA分子转染至HT-29细胞内；siRNA-648在37.5nM、75nM、150HM及300nM浓度下对Livin基因均有抑制作用，而siRNA-1273在上述各浓度下均对Livin基因无明显抑制作用；150nM浓度的siRNA转染HT-29细胞后24h在mRNA和蛋白质水平均观察到Livin表达受抑，48h抑制程度最明显，而96h后Livin表达开始恢复，144h后Livin mRNA基本恢复至转染前水平。 3.2转染siRNA-648后HT-29细胞周期发生改变，G1期细胞比例升高而S期细胞比例下降；HT-29细胞凋亡率升高(2.4±0.5﹪vs 16.5±2.8﹪，P<0.05)；Livin基因抑制后细胞Caspase-3活性明显增加(0.160±0.023 vs 0.347±0.058，P<0.05)。 3.3单用5-FU、CPT-11、Oxaliplatin时，三药的IC50分别为1.87ug/mL、4.43ug/mL及1.04μg/mL；当先利用siRNA-648抑制Livin基因后，三药的IC<,50>分别为1.16ug/mL、1.96 ug/mL及0.36 ug/mL，siRNA-648和3种化疗药物均具有明显增效作用，增敏倍数分别为1.61、2.26和2.61。 3.4 HT-29与CPT-11、5-FU、Oxaliplatin共孵48h后，Livin的基因表达并无明显改变，提示siRNA-648通过其他方式与化疗药物产生增效作用。 4 结论： 4.1siRNA-648能有效抑制Livin基因的表达，伴随着细胞凋亡增加和细胞周期重新分布及Caspase-3活性增加；siRNA与5-FU、CPT-11及Oxaliplatin均具协同作用，Livin基因可能是结直肠癌的潜在的治疗靶点。 4.2HT-29与化疗药物共孵后Livin基因并无变化，提示其与siRNA-648的协同作用系通过其他的机制进行。

目录

文摘

英文文摘

第一章Survivin、Livin在Dukes'B期结直肠癌中的表达及其临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

第二章siRNA抑制HT-29细胞中Livin基因表达的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

主要缩略词

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