荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤的构建及其修复皮肤缺损的实验研究

摘要

[目的] 构建荷载KGF纳米微囊的新型组织工程皮肤，研究其对裸鼠皮肤缺损的修复效果。 [方法] 1．荷载KGF纳米微囊ADM(KGF-ADM)的构建：采用超声乳化一溶剂挥发及低温干燥方法，将KGF以牛血清白蛋白(BSA)作联接包裹在聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)内形成纳米微囊，并采用低温干燥的方法将微囊交联于脱细胞真皮(ADM)上。检测纳米微囊的释放规律及载药量、包圭摔等指标，在扫描电镜下观察微囊形态及其与ADM的交联情况。 2．表皮干细胞的培养及鉴定：采用I型胶原酶复合胰蛋白酶消化方法，从健康人包皮组织取得表皮干细胞群，分别进行Hoechst 33342复合β1-整合素(integrin)-氰3(Cy3)免疫荧光鉴定，并对比培养基添加角质细胞生长因子(KGF)与否对表皮细胞群生长曲线的影响，观察其体外增殖情况。同时，用胰蛋白酶消化包皮的真皮层分离得到成纤维细胞并体外培养扩增。 3．细胞在荷载KGF纳米微囊ADM及PLGA上的生长情况：KGF-ADM经紫外线照射消毒后，在其上接种表皮干细胞群，培养3天后，在扫描电镜下观察细胞生长情况。 4．荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤的构建及其对裸鼠皮肤缺损的修复效果：KGF-ADM经紫外线照射消毒后，在其上接种表皮干细胞群，体外培养一周后，翻转KGF-ADM，在其反面接种同期分离的成纤维细胞，继续培养一天后，移植于裸鼠背部皮肤缺损处，以裸鼠自体皮肤移植作对照，以无KGF纳米微囊的组织工程皮肤为空白组，观察在2周、4周及6周时各组修复区愈合情况及皮片挛缩情况，收集各组修复区皮肤作病理切片，行H-E染色在光学显微镜下观察表皮层及真皮层细胞情况，并行抗人K10-FITC及抗人β1-integrin-Cy3免疫荧光检测，了解修复区表皮细胞分层情况及是否仍存有干细胞。 [结果]采用超声乳化-溶剂挥发及低温干燥方法可成功制作KGF纳米微囊，纳米微囊成球率为85﹪，载药量为17.3﹪，包封率为73.5﹪。纳米微囊中BSA可以控制缓慢释放，释放初期，释放速度较快，前5日已累计释放约40﹪，后进入缓慢释放期，30日时累计释放约75﹪。扫描电镜检测显示：微囊球形形态良好，球体表面光滑无皱褶，在ADM表面分布均匀，与ADM连接紧密，大部分微囊均匀分布于ADM表面，有小部分分布于ADM深面。采用Ⅰ型胶原酶复合胰蛋白酶消化方法取得的表皮细胞群中，含有β1-integrin表达阳性的干细胞。表皮干细胞群在KGF-ADM表面生长情况良好，细胞形态多样，与KGF-ADM粘贴紧密，可见到小圆形且成团分布的干细胞及多角形的终末细胞，细胞形态规则，活性良好，有连接成片的趋势，部分形成克隆团块。以荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损，2周、4周及6周时修复效果均优于对照组及空白组，移植之皮肤边缘可与临近皮肤完全融合，存在一定的挛缩，镜下可见到其表皮细胞分层良好，能产生正常角质层，8周及10周时实验组切片行免疫荧光检测可见到基底层仍存有极少数β1-integrin阳性细胞，可能为表皮干细胞或短暂扩充细胞。 [结论] 采用本方法可成功制作可控释KGF纳米微囊并紧密交联在ADM上，以其为支架可在短期内构建荷载KGF纳米微囊的新型组织工程皮肤，该皮肤修复裸鼠皮肤缺损的效果优于自体全厚皮片移植及无荷载KGF纳米微囊的普通组织工程皮肤移植。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

前言

1.材料与方法

1.1.材料及仪器

1.2.方法

2.结果

2.1.纳米微囊成球率、载药量及包封率

2.2.体外药物释放实验

2.3.表皮细胞群体外培养生长曲线的绘制

2.4.表皮细胞免疫荧光检测

2.5.KGF纳米微囊的形态及其在ADM上的分布

2.6.细胞在KGF-ADM上的生长情况

2.7.细胞在PLGA上的生长情况

2.8.裸鼠皮肤缺损修复情况

3.讨论

3.1 KGF对表皮细胞的作用

3.2 KGF纳米微囊的制备及其与ADM的联结

3.3纳米微囊控制缓释KGF对表皮干细胞群生长的作用

3.4荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤对裸鼠皮肤缺损的修复作用

结论

创新之处

展望

参考文献

附图1

附图2

附录

致谢

原创性声明