重组四价Aβ基因工程肽的制备

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种多见于老年人的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为认知功能障碍和记忆损害。随年龄增加，AD的发病率不断上升。它的主要病理改变为患者脑内出现β-淀粉样蛋白(β-amyloidpeptide，Aβ)沉积形成的老年斑，神经纤维缠结及神经元丢失。从报道首例AD病例到现在已近100年，AD的病因及其病理机制仍不十分明确，目前存在多种学说和假设，其中以Aβ毒性学说为大多数学者所接受。该学说认为Aβ生成、聚合、沉积，继而形成老年斑，同时伴随神经元损害，是AD病理机制的中心环节。近年的研究对该学说有了进一步补充，认为Aβ寡聚体的形成也是AD致病的主要原因。围绕Aβ致病学说展开的以β-淀粉样蛋白为靶的免疫治疗是近年AD治疗的热点。 1999年Schenk等人首次报道用化学合成的Aβ<,42>肽疫苗皮下接种AD转基因鼠，产生了特异性的抗Aβ<,42>抗体，阻止和减少了淀粉样斑块的形成。随后多个独立实验室先后发现采用主动免疫或被动免疫的方法均可以减少或清除AD转基因鼠脑内的淀粉样斑块沉积并且改善了动物的记忆功能和认知能力。2001年，Elan公司率先进行了抗老年性痴呆疫苗AN1792(主要成分为Aβ<,42>和佐剂QS-21)的Ⅰ期临床试验，取得了良好的效果。但在Ⅱ期临床试验中，约6﹪的患者接种后出现了脑脊髓膜炎的症状，试验被迫中止。随后的尸检发现患者脑组织中存在T细胞和巨噬细胞浸润。通过大量随访和实验，多数研究者们认为Aβ<,42>肽C末端的T细胞表位激发了Th1反应，从而诱发炎症反应可能是Aβ<,42>肽疫苗免疫产生副作用的主要原因。选择含有尽量少的引发细胞免疫的T细胞抗原决定簇，保留引发体液免疫的B细胞抗原决定簇的Aβ肽亚单位疫苗已成为大多数研究者的共识。随后多家实验室采用化学合成或基因工程的方法制备出不同的Aβ亚单位片段加入不同类型佐剂免疫动物后，发现具有和Aβ<,42>肽疫苗同样的免疫效果，同时避免了不良反应。本课题组自2001年开始AD系列疫苗的研究以来，先后合成和构建了MAP-Aβ<,1-15>肽疫苗，s4×Aβ<,1-15> DNA疫苗，GSN×Aβ<,1-15>和His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白疫苗等，在动物实验上均诱导出了较高的特异性抗体，减少了老年斑的沉积，改善了模型鼠的学习记忆功能。 目的： 本课题在前期研究的基础上，拟去除前期构建的PQE-4×Aβ<,1-15>载体目的基因前方不相关的基因片段，得到理论上更安全的疫苗。在设计上去除了Aβ的T细胞抗原决定簇，保留了B细胞抗原决定簇避免了Aβ的毒性片段，同时采用柔性肽连接多个抗原片段，选择较理想的纯化标签和载体，用基因工程的方法制备新的四价Aβ亚单位蛋白疫苗，为开发出更安全、廉价、效果理想的具有自主知识产权的治疗AD的疫苗奠定基础。 材料和方法： 1.重组原核表达载体PQE30a-2×Aβ<,1-15>的构建及鉴定 本室前期通过基因合成和PCR技术扩增，得到六个甘氨酸连接的Aβ<,1-15>二价B细胞抗原表位基因片段，再用GSGGSG linker串联这两个Aβ<,1-15>二价基因片段，命名为4×Aβ<,1-15>，克隆入PcDNA3.1载体，构建成功了PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表达载体。本实验在此基础上，以PcDNA3.1-S4×Aβ<,1-15>质粒为模板，由于Aβ<,1-15>片段四次串联重复，在引物设计时引物与模板的匹配不能完全一致，故考虑先扩增两个Aβ<,1-15>二价基因片段减少非特异性扩增。设计上、下游引物时分别引入BamHI和SacI酶切位点，经PCR扩增出目的基因片段1-2×Aβ<,1-15>。将目的片段纯化后酶切克隆入原核表达载体PQE30a中，转化感受态细菌后挑取阳性菌落扩大培养，提取质粒并酶切鉴定，根据电泳情况初步确定阳性克隆，命名为PQE30a-2×Aβ<,1-15>，将菌液送上海生物工程公司测序，进一步鉴定。 2.重组质粒PQE30a--4×Aβ<,1-15>的构建及鉴定 根据测序正确的PQE30a-2×Aβ<,1-15>质粒为模板扩增另外两个Aβ<,1-15>片段，较之以PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>为模板特异性更高。引物设计时上、下游分别引入SacI和HindlIl酶切位点，经PCR扩增出目的基因片段2-2×Aβ<,1-15>。将目的片段纯化酶切后克隆入PQE30a-2×Aβ<,1-15>重组质粒中，转化感受态细菌后挑取阳性菌落扩大培养，提取质粒并酶切鉴定，根据电泳情况初步确定阳性克隆，命名为PQE30a-4×Aβ<,1-15>，将菌液送上海生物工程公司测序，进一步鉴定。 3.重组表达载体PQE30a-4xAβ<,1-15>在M15中的诱导表达 从E.Coli DH5α中提取重组质粒PQE30a-4×Aβ<,1-15>纯化后转化入表达菌E.Coli M15菌株中，摸索表达条件，包括IPTG浓度，诱导时间和诱导温度，使目的蛋白为可溶性表达，并得到较大表达。表达后裂解菌体，取上清进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定，鉴定其表达产物是否为我们所需的可溶的目的蛋白。 4. 目的蛋白His6-4×~Aβ<,1-15>的大量诱导表达及纯化 采用优化好的诱导条件进行大量表达His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白，利用6×his标签通过Ni<,2+>-NTA亲和层析纯化目的蛋白，小量纯化摸索纯化条件，15﹪SDS-PAGE电泳分析纯化效果，大量纯化目的蛋白后用超滤浓缩管超滤、浓缩，并进行定量。 结果： 1.构建了重组原核表达载体PQE30a-2×Aβ<,1-15>以PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表达质粒为模板，相应的引物PCR扩增出目的片段1-2×Aβ<,1-15>基因，其大小为110 bp，且同时正确引入了相应的酶切位点。克隆入PQE30a载体后，转化入DH5α感受态中，挑取阳性克隆，酶切鉴定的结果表明目的基因已插入至PQE30a，中，测序结果表明重组载体中的2×Ap<,1-15>基因序列与已知序列相符合，未发现突变的碱基，且密码子读框正确。 2.构建了重组原核表达载体PQE30a-4×Aβ<,1-15>以测序正确的PQE30a-2×Aβ<,1-15>为模板，相应的引物PCR扩增出目的片段2-2×Aβ<,1-15>基因，其大小为110 bp，且同时正确引入了相应的酶切位点。克隆入PQE30a--2×Aβ<,1-15>载体后，转化入DH5α感受态中，挑取阳性克隆，酶切鉴定的结果表明目的基因已插入至PQE30a--2×Aβ<,1-15>中，在220 bp中可见4×Aβ<,1-15>的目的条带，测序结果表明重组载体中的4×Aβ<,1-15>基因序列与已知序列相符合，未发现突变的碱基，且密码子读框正确。 3.小量表达了目的蛋白His6-4xAβ<,1-15>PQE30a-4×Aβ<,1-15>转化入EColi M15中，最佳诱导条件为IPTG 1 mM，30℃低温诱导9 h可以获得一定表达量的可溶性目的蛋白His6-4×Aβ<,1-15>，15﹪SDS-PAGE电泳在18 KD处可见诱导后有新生目的条带，且主要在上清中，Western blotting鉴定为我们所需的目的蛋白，可以和抗Aβ<,40>抗体特异性结合，具有免疫反应性。 4.大量表达和纯化了His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白以最佳诱导条件大量表达出目的蛋白，用Ni<'2+>-NTA亲和层析纯化目的蛋白，以40 mM咪唑浓度为洗涤浓度，300 mM咪唑浓度为洗脱浓度，15﹪SDS-PAGE电泳在18 KD处可见单一的目的条带。纯化后的目的蛋白经超滤管超滤、浓缩，定量后保存于-20℃。 结论： 1.利用基因工程的原理和技术成功构建了优化的原核表达载体PQE30a-4×Aβ<,1-15>，测序结果表明插入的目的基因序列无突变。 2.诱导表达了His<,6-4>×Aβ<,1-15>融合蛋白，且大部分为可溶性表达，并通过Ni<'2+>+-NTA树脂纯化，制备了四价B细胞抗原表位串联的Aβ<,1-15>多肽。 3.Western blotting结果显示制备的His<,6-4>×Aβ<,1-15>融合蛋白可以和抗Aβ<,40>抗体特异性结合，具有免疫反应性。

目录

文摘

英文文摘

前 言

材料与方法

实验结果

讨论

小 结

参考文献

英文缩略词语

致谢

原创性声明