17β-雌二醇影响人牙周韧带细胞增殖及表达OPG/RANKL的实验研究

摘要

本研究拟在体外培养人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)，观察17 β-雌二醇对hPDLCs的增殖和表达碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性的影响，并探讨不同浓度17 β-雌二醇对hPDLCs表达骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和核因子kappa B受体活化剂配体(receptoractivator of nuclear factor κB Ligand，RANKL)的生物学效应。 材料和方法: 1．采用组织块法培养hPDLCs。取因正畸原因拔除的健康前磨牙，无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜，组织块法培养hPDLCs，以SABC法进行波形丝蛋白和角蛋白的染色鉴定。 2．观察17 β-雌二醇对hPDLCs增殖和表达ALP活性的影响。取第3-5代hPDLCs细胞，实验组加入0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM和1000 nM 17β-雌二醇，MTT法检测第24 h、48 h和72 h时间点PDLCs的增殖情况；测定第7d、14d和21d的细胞ALP活性。 3．研究17 β-雌二醇对hPDLCs表达OPG/RANKL蛋白的影响。取第3-5代hPDLCs细胞，设立0 nM对照组，免疫组化法观察对照组hPDLCs的OPG/RANKL蛋白表达；实验组加入0.1 nM、1 nM、10 nM和100 nM 17 β-雌二醇，ELISA检测12 h、24 h、48 h、72 h OPG分泌的变化。 4．RT-PCR检测17 β-雌二醇对hPDLCs表达OPG/RANKL mRNA的影响。各不同浓度17 β-雌二醇组作用72 h后，以半定量RT-PCR检测hPDLCs细胞内OPG/RANKL mRNA的相对表达量。 结果: 1．组织块法成功培养出hPDLCs。hPDLCs最早在第7d自组织块内爬出，约15d长满瓶底的80﹪，细胞呈梭形或星形，波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证实来源于问充质，无上皮成分混杂。 2．MTT法检测显示：与0 nM对照组相比，各浓度17β-雌二醇OD值差异无统计学意义(P>0.05)。17 β-雌二醇作用hPDLCs 14 d和21d后，ALP活性检测值增高(P<0.05)。 3．免疫组化结果显示，在hPDLCs内可以检测到OPG/RANKL蛋白的表达。 4．ELISA法检测培养细胞上清液中OPG浓度，发现OPG的分泌量具有时间依赖性。在48h和72h，生理浓度(1 nM)17β-雌二醇能使OPG的分泌增加(P<0.05)，高浓度(100 nM)OPG的分泌无影响(P>0.05)。 5．RT-PCR结果显示，17β-雌二醇在生理(1 nM)浓度时OPG mRNA的表达升高， RANKL mRNA降低， OPG/RANKL比率升高；高浓度(100 nM)时，17 β-雌二醇OPG mRNA的表达降低，RANKL mRNA的表达增高，OPG/RANKL比率降低。 结论: 1．17 β-雌二醇对hPDLCs的增殖无明显影响，但促进hPDLCs中ALP表达。 2．生理浓度17 β-雌二醇能促进hPDLCs分泌OPG蛋白，表达OPG mRNA，抑制RANKL mRNA的表达；高浓度17 β-雌二醇则抑制OPG mRNA表达，促进RANKL mRNA的表达。 3．调节人牙周韧带细胞OPG/RANKL表达可能是17 β-雌二醇介导牙周组织健康的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

引言

第1章人牙周韧带细胞的体外培养

第2章17β-雌二醇对人牙周韧带细胞增殖及ALP活性的影响

第3章17β-雌二醇对人牙周韧带细胞表达OPG/RANKL的影响

全文总结

参考文献

缩略词表

附图

附录

致谢

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