MSCs在膀胱脱细胞基质上的生长及分化研究

摘要

目的 膀胱的先天性疾病、缺损、肿瘤等常需要进行膀胱的替代治疗，传统治疗手段存在诸多缺点，组织工程的出现为膀胱缺损的修补提供了新的选择。种子细胞、支架材料及合适的微环境是膀胱组织工程的三大要素。传统的方法因种子细胞的自身缺陷存在诸如来源短缺、培养困难及不能排除肿瘤等诸多问题，而干细胞因具有来源丰富、获取便利、增殖力强、可多向分化等诸多优点成为理想的种子细胞选择之一。膀胱脱细胞基质作为支架材料具有组织特性良好、来源广泛等优点。本实验拟体外培养大鼠骨髓问充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)为种子细胞，制各猪膀胱脱细胞基质(Bladder Acellular Matrix，BAM)为支架材料，进行体外体内复合培养，检测其相容性，并试图模拟合适的微环境诱导生长分化，初步探讨以其构建组织工程膀胱的可行性。 材料与方法 1．实验动物与材料1月龄SD大鼠，雌雄不限，体重80～100g；新鲜猪膀胱。 2．实验试剂与器材DMEM-LG、标准胎牛血清(FBS)、0.25﹪胰蛋白酶(含0.02﹪EDTA)、肝素钠、磷酸盐缓冲液(PBS)；曲拉通X-100，1﹪新洁尔灭溶液，10﹪硫酸庆大霉素溶液，摇床；细胞计数板；重组人VEGF<,165>，细胞计数板；二甲苯、无水乙醇、Mouse-anti-Pan Cytokeratin、sp免疫组化试剂盒、DAB显色剂、苏木素；戊巴比妥钠(Pentobarbltal sodium)、外科手术器械等。 3．骨髓间充质干细胞的体外培养扩增采用全骨髓法分离培养MSCs，倒置显微镜下观察细胞生长状态，行流式细胞仪(FACScan流式细胞仪)检测细胞表面抗原CD29、CD45。 4．猪膀胱脱细胞基质的制备取新鲜猪膀胱，直视下分离去除浆肌层，保留粘膜及粘膜下层，以Triton-X100进行萃取脱细胞处理。标本作病理组织HE染色，观察分析脱细胞效果。 5．细胞一材料的体外复合培养、体内分化实验5.1．种子细胞生长的微环境：取第三代大鼠MSCs，常规方法传代，以含20﹪FBS、并添加VEGF(终浓度为25ng/L)的DMEM-LG培养液放入37℃、5﹪CO<,2>饱和湿度的孵箱中培养。 5.2．细胞-材料的体外复合培养实验：材料剪成小块置入24孔板内，以DMEM-LG培养液预湿48h。将微环境培养的细胞以10<'5>/ml的密度接种到24孔板内，置培养箱培养。取同期培养的MSCs作为对照。培养后第2天开始行细胞计数：每天各取每组的2孔消化离心进行细胞计数，连续12天，绘制细胞生长曲线，将两组曲线进行对比。 5.3．细胞-材料的体内分化实验：材料剪成块置入6孔板内，以DMEM培养液预湿48h。将微环境培养的细胞以10<'5>/ml的密度接种到6孔板内，置培养箱培养14天。设未种植细胞的材料为对照组。将培养14d的细胞一材料复合物剪成小块异位移植入12只大鼠背部，左边植入实验组，右边植入未种植细胞的材料作为对照，四周及八周后各取6只取材行病理切片，检查细胞在材料表面的生长情况及上皮的再生情况等。 实验结果 倒置显微镜下观察原代培养贴壁生长良好，传代后形态良好，增殖能力强，三代后以流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29阳性、CD45阴性，说明MSCs达到较高纯度。 制备的猪BAM质地柔软，弹性良好，半透明，镜下可见主要成份是胶原及弹性纤维，未见细胞成份。 细胞一材料的体外复合培养实验：实验组与对照组的细胞有相似的生长曲线，说明细胞在材料表面生长良好，相容性较好。 细胞-材料的体内分化实验：细胞在材料上生长良好，四周时可见薄层、不连续的单层上皮细胞生长，实验组上皮细胞角蛋白免疫组化阳性率50.0﹪，对照组阳性16.7﹪；八周时可见薄层、不连续的多层上皮生长，实验组上皮细胞角蛋白免疫组化阳性率83.3﹪，对照组阳性率16.7﹪。 结论 制备的细胞与材料具有良好的相容性，体内可向上皮细胞分化生长；复合物与体内组织具有良好的相容性。MSCs和BAM可作为构建组织工程膀胱的材料。

目录

文摘

英文文摘

引言

材料及方法

结果

讨论

结论

展望

参考文献

附图

附一 实验试剂与器材

附二 缩略词表

致谢

原创性声明