传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF24和ORF50囊膜蛋白鉴定及基因工程候选疫苗的研制

摘要

传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)属于虹彩病毒科，肿大细胞病毒属。是可以导致鳜鱼、美国红鱼等名贵水产鱼类大批死亡的重要病源之一，近年来造成了严重的经济损失。为了研制其基因工程疫苗，控制该病毒的流行，通过生物信息学软件分析，在ISKNV基因组中筛选了2个可能编码囊膜蛋白的开放读码框(OpenReadingFrame，ORF)ORF24和ORF50。 根据GenBank上ORF24和ORF50的核苷酸序列，分别设计了一对特异性引物，采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了两个基因。将这两个基因连接到原核表达载体pET32a(novagen)，构建了重组表达载体pET32a-24和pET32a-50，再将其转化大肠杆菌BL21进行融合表达，融合蛋白VP24分子量约为50.6KD，VP50约为31.1kD，经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定，证实了BL21正确表达了目的蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在，提取的包涵体中融合蛋白含量占50％以上，经柱层析纯化蛋白，纯化度达90％以上。 以SDS-PAGE纯化的两种融合蛋白作抗原，分别免疫新西兰兔制备多克隆抗体。ELISA检测两种抗血清效价达1:11000。Western-blot检验，两种抗血清中的IgG都能与目的蛋白发生特异性反应。 从病鱼组织中提取ISKNV病毒粒子。利用葡萄球菌pansorbine能吸附抗血清中的IgG，辅助抗原抗体特异性结合的特性，检测两种多克隆抗体是否能与病毒囊膜特异性结合，从而证明相应基因的功能。结果ORF50编码囊膜蛋白。 将重组菌BL21/pET32a-24和pET32a-50表达的融合蛋白制备成疫苗，给鳜鱼注射进行主动免疫。阴性对照组注射PBS不攻毒，阳性对照组不免疫(以下同)。两种蛋白的为混合疫苗免疫鳜鱼效果最好，最后疫苗组相对存活率(relativepercentagesurvival，RPS)有75％。同时，阴性对照组无死亡，而阳性对照组全部死亡(以下同)。 被动免疫，先注射多克隆抗血清24小时后再注射病毒液，RPS60％；先注射病毒液24小时后再多克隆抗血清，RPS20％。中和实验，将两种兔抗融合蛋白血清与病毒液1:1:1比例混合，常温孵育10-15分钟后，注射鳜鱼，RPS为80％。 对广东南海2000尾池养鳜鱼进行ISKNV基因工程疫苗中试，免疫方法和主动免疫相同。随即抽取20尾攻毒，RPS有70％。免疫实验表明所制备的疫苗对ISKNV感染有较强的抑制作用。 发酵罐大规模表达融合蛋白实验结果，5L规模的发酵罐，采用LB培养基，终浓度1mMIPTG诱导表达，37℃培养4-5小时，最后可制备融合蛋白包涵体8g左右。

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论文说明:缩略词

声明

第一章虹彩病毒研究进展

1.1虹彩病毒形态结构

1.2虹彩病毒科的分类及宿主种类

1.3基因组结构

1.4蛋白组结构及预测的功能基因

1.5虹彩病毒的增殖

1.6肿大细胞病毒属

1.7传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)

1.8虹彩病毒疫苗研究进展

1.9本课题的目的和意义

第二章ISKNV ORF24，ORF50基因序列生物信息学分析

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论

2.4小节

第三章ISKNV ORF24，ORF50基因重组表达质粒的构建及在大肠杆菌中的融合表达

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

3.4小结

第四章ISKNV的ORF24和OPF50基因融合表达蛋白多克隆抗体的制备

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3讨论

4.4小结

第五章ISKNV的ORF24和ORF50基因表达蛋白定位

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3讨论

5.4小节

第六章鳜鱼的免疫保护

6.1材料与方法

6.2结果与分析

6.3讨论

6.4小结

全文总结

参考文献

硕博连读期间发表论文及其它成果

致谢