超氧化物歧化酶（SOD）在酵母系统中的表达研究

摘要

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种广泛存在于各类生物体中的抗氧化酶，是机体内超氧阴离子自由基(O<,2><,->)的天然消除剂，在防御O<,2><'->的毒性、抗炎、抗免疫性疾病、抗衰老以及预防肿瘤等方面起着重要的生理作用。其中，人EC-SOD是人体细胞外体液中最主要的SOD，在许多病理生理问题上都有着重要的应用价值。中国拟青霉(Paecilomyces．sinensis)被认为是珍贵的冬虫夏草的具有药效的无性型之一，具有很好的抗氧化作用，其Cu，Zn-SOD极有可能成为有效的冬虫夏草代用资源。 本论文首先利用已构建好的重组原核表达载体pQE30-EC-SOD在大肠杆菌M15中诱导表达人EC-SOD蛋白，经Ni-NTA技术纯化后，作为抗原免疫大白兔，得到效价较高、特异性良好的EC-SOD多克隆抗体，以用于后续实验中重组EC-SOD表达产物的鉴定和纯化。 同时本论文利用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达了重组人EC-SOD。首先将人EC-SOD基因克隆至毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组质粒pPICZαA-EC-SOD，电击转化毕赤酵母KM71细胞，经PCR鉴定、Zeocin抗性筛选得到含人EC-SOD基因的高拷贝转化子。通过BMGY/BMMY摇瓶培养，诱导表达重组蛋白。表达产物经SDS-PAGE、Western blot和SOD酶活力检测，证明为具有较高酶活力的人EC-SOD蛋白，最高酶活达3976U/mg(邻苯三酚自氧化法)。通过正交试验，在pH值、离子添加和甲醇浓度三个因素上，对EC-SOD在毕赤酵母中诱导表达条件进行了优化。此外，本论文还在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中食品级表达了中国拟青霉的Cu，Zn-SOD。将中国拟青霉Cu，Zn-SOD基因克隆至酿酒酵母表达载体oYES2/CT后，ApaLI和Nco I双酶切去除载体上的Amp<'r>抗性基因和一段URA3片段，通过PCR扩增、T4连接，把被切除的URA3片段重新与载体连接，从而构建没有抗生素标记的食品级表达载体pYES-psSOD-F。将食品级载体转化酿酒酵母w303-1a细胞，利用尿嘧啶营养缺陷型筛选，得到含pYES-psSOD-F的阳性克隆。然后以半乳糖诱导重组菌表达外源蛋白，诱导48h后表达产物经破壁进行SDS-PAGE电泳和SOD酶活力检测，结果表明外源蛋白得到表达，并且具有SOD酶活力。

目录

文摘

英文文摘

第1章综述

1.1超氧化物歧化酶

1.1.1 SOD的发现、分布、种类、结构及性质

1.1.2 SOD的应用

1.1.3 SOD的国内外水平与动态

1.2中国拟青霉

1.2.1冬虫夏草

1.2.2中国拟青霉

1.3酵母表达系统

1.3.1毕赤酵母表达系统

1.3.2酿酒酵母表达系统

1.4本研究的目的和意义

第2章EC-SOD多克隆抗体的制备

2.1材料

2.1.1实验材料

2.1.2主要试剂

2.1.3主要溶液

2.1.4培养基

2.1.5主要仪器

2.2方法

2.2.1抗原的制备

2.2.2免疫动物

2.2.3 ELISA法测定抗体效价

2.2.4 Western Blot方法检测抗体的特异性

2.3结果与分析

2.3.1 EC-SOD蛋白的纯化后检测

2.3.2 ELISA法测定EC-SOD抗体效价

2.3.3 Western Blot方法检测抗体的特异性

2.4讨论

第3章EC-SOD在毕赤酵母中的表达及条件优化

3.1材料

3.1.1实验材料

3.1.2主要试剂

3.1.3主要溶液

3.1.4培养基

3.1.5主要仪器

3.2方法

3.2.1 EC-SOD基因片段的获得

3.2.2重组表达载体pPICZαA-EC-SOD的构建

3.2.3 EC-SOD在毕赤酵母中的表达

3.2.4 EC-SOD在毕赤酵母中表达条件的优化

3.3结果与分析

3.3.1 EC-SOD基因片段的获得

3.3.2重组表达载体pPICZαA-EC-SOD的构建

3.3.3 EC-SOD在毕赤酵母中的表达

3.3.4不同诱导条件下EC-SOD表达产物的SOD酶活力

3.4讨论

第4章中国拟青霉Cu，Zn-SOD在酿酒酵母中食品级表达的初步研究

4.1材料

4.1.1实验材料

4.1.2主要试剂

4.1.3主要溶液

4.1.4培养基

4.1.5主要仪器

4.2方法

4.2.1中国拟青霉Cu，Zn-SOD基因片段的获得

4.2.2重组表达载体pYES-psSOD的构建

4.2.3食品级重组表达载体pYES-psSOD-F的构建

4.2.4 psSOD在酿酒酵母中食品级表达

4.3结果与分析

4.3.1中国拟青霉Cu，Zn-SOD基因片段的获得

4.3.2重组表达载体pYES-psSOD的构建

4.3.3食品级重组表达载体pYES-psSOD-F的改造

4.3.4 psSOD在酿酒酵母中食品级表达

4.4讨论

结论与展望

参考文献

缩略词

致谢

原创性声明