长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶基因的结构与功能研究

摘要

重金属污染是严重的环境问题。植物修复就是利用植物吸收、富集以除去环境中的污染物尤其是重金属污染物或者将其转变成毒性较低的物质的过程，植物修复以其廉价、安全与环境友好的特点，给重金属环境污染的修复提供了新的途径。对植物耐受和富集重金属机制的研究表明在植物体内能够螯合重金属的蛋白质主要是金属硫蛋白(MTs)与植物螯合肽(PCs)。其中植物螯合肽的结构为(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2-11)，它不是基因的直接编码产物，而是以谷胱甘肽(GSH)为底物，在植物螯肽合成酶(PCS)的催化下合成的。PCS能够被金属离子激活，高度保守的N-端是催化结构域，而其C-端则是多变的。已经从很多植物、酵母以及动物与原核生物中克隆了PCS基因，并发现在原核生物和酵母中超量表达PCS基因可提高对重金属的抗性，但通过转基因植物研究得到的结论却不一致。
　　 长喙田菁(Sesbania rostrata)是一种豆科植物，固氮能力强、生长速度快、生长周期短、生物量大。长喙田菁对重金属尤其是锌与镉具有一定的抗性，但对重金属的富集能力不强。为了研究长喙田菁的重金属抗性机理以及采用基因工程方法提高其重金属超富集能力，本论文对长喙田菁的植物螯合肽合成酶基因(SrPCS)的结构与功能进行了研究，取得以下结果:
　　 通过克隆SrPCS的基因组DNA序列，并与已克隆的SrPCScDNA序列进行比较，证实该基因可通过选择性剪接产生4个mRNA(SrPCS1-4)。除了在SrPCS4的产生过程中有一个新的内含子，其两端是短的CTCC的重复序列外，其他内含子的两端都遵守GT-AG规则。这4个通过选择性剪接产生的mRNA的开放阅读框长度是不同的，其中SrPCS3最长，有1506 bp，SrPCS1有702 bp，而SrPCS2与SrPCS4只有534 bp；它们编码的蛋白质的长度分别是501、233、177及177个氨基酸。
　　 SrPCSs在长喙田菁植株中的表达量很低，无法采用northern-blot方法进行检测。通过real-time PCR的分析发现，其中的SrPCS3主要在叶中表达，其表达量的高低与Cd2+的诱导有关，当用100μM Cd2+处理24小时其表达量略有增加，但用300μM Cd2+处理后其表达会显著降低。
　　 通过氨基酸序列比较和Swiss-Model同源建模分析发现SrPCSs的N-端与其他植物PCS一样是高度保守的，其中SrPCS1与SrPCS3相同，在它们N-端具有Cys56、His162及Asp180三个保守氨基酸，这三个氨基酸对应于蓝细菌NsPCS中的Cys70、His183及.Asp201，可以组成类似于木瓜蛋白酶超家族中的半胱氨酸蛋白酶的三联体催化结构域，但SrPCS2与SrPCS4只含有这三个氨基酸中的Cys56。
　　 本研究在大肠杆菌中表达并纯化获得了重组SrPCS1-4融合蛋白，以GSH作为底物分析了融合蛋白的催化活性，发现融合蛋白SrPCS1与SrPCS3具有酶活性，并且SrPCS3的催化活性高于SrPCS1，但SrPCS2及SrPCS4没有催化活性。
　　 通过在酵母中的表达进一步比较分析了SrPCS1-4的PCS活性。研究结果表明表达.SrPCS1与SrPCS3的酵母显著提高了对Cd2+的抗性，但对其他重金属(Zn2+、Cu2+及pb2+)的抗性则没有改变，并且表达SrPCS3的酵母对Cd2+的抗性高于表达SrPCS1的酵母；而表达SrPCS2及SrPCS4的酵母不能够提高对重金属的抗性。
　　 获得了超量表达SrPCS1-4的转基因烟草，Cd2+抗性初步分析表明SrPCS1与SrPCS3的超量表达可以提高转基因烟草对Cdz+的抗性，但不能够增加植物对Cd2+的富集能力；而表达SrPCS2及SrPCS4的转基因烟草对Cd2+的抗性没有改变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第1章 研究背景及目的与意义

1.1 重金属污染及其危害

1.2 植物修复的概念和类型

1.2.1 植物修复的概念

1.2.2 植物修复的优缺点

1.2.3 植物修复的类型

1.3 超富集植物的概念及其抗重金属机制

1.3.1 超富集植物的概念

1.3.2 超富集植物的抗重金属机制

1.4 植物基因工程在植物修复中的应用

1.5 PC的结构、类型、合成与功能

1.5.1 PC的结构与类型

1.5.2 PC的合成

1.5.3 PC的作用

1.5.4 PCs与金属(尤其是Cd2+)复合物在液泡中累积

1.6 植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase，PCS)与PCS基因

1.6.1 PCS的结构、特点与作用

1.6.2 PCS的催化机制

1.6.3 PCS基因的克隆与表达研究

1.6.4 PCS转基因植物的研究进展

1.7 长喙田菁及其重金属抗性研究

1.8 本研究的目的与意义

第2章 长喙田菁SrPCS基因的结构与镉诱导下的表达分析

2.1 前言

2.2 材料和试剂

2.2.1 材料

2.2.2 试剂

2.2.3 溶液配制

2.3 主要仪器

2.4 实验方法

2.4.1 长喙田菁的水培

2.4.2 本章所用PCR引物的设计

2.4.3 植物总RNA的提取

2.4.4 RNA的DNaseI处理

2.4.5 3’端cDNA的扩增(根据试剂盒的说明书进行)

2.4.6 PCR产物的回收(低熔点琼脂糖法)方法

2.4.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备

2.4.8 待克隆片段与pGEM-Teasy的连接及转化E.coli DH5α感受态细胞

2.4.9 重组克隆的鉴定

2.4.10 DNA序列分析

2.4.11 CTAB法大量提取植物DNA

2.4.12 基因组DNA的PCR

2.4.13 northern印迹杂交

2.4.14 反转录反应

2.4.15 长喙田菁GAPDH cDNA的PCR扩增

2.4.16 实时定量PCR条件的优化

2.4.17 实时定量PCR

2.4.18 实时定量PCR结果处理

2.5 实验结果

2.5.1 SrPCS基因组DNA序列的获得

2.5.2 SrPCS cDNA 3’端序列的扩增

2.5.3 SrPCS基因的结构分析

2.5.4 SrPCSs与其它生物PCS序列系统进化树分析

2.5.5 在重金属Cd诱导下SrPCS表达的northern杂交分析

2.5.6 利用实时定量PCR分析SrPCSs的表达情况

2.6 讨论

第3章 SrPCSs在大肠杆菌中的表达分析

3.1 前言

3.2 材料与试剂(凡本章所用材料和试剂未在此处列出者见2.4)

3.2.1 材料

3.2.2 实验所需试剂：

3.2.3 培养基

3.2.4 溶液配制

3.3 仪器及设备

3.4 实验方法

3.4.1 DNA及蛋白质序列分析

3.4.2 引物设计

3.4.3 PCR反应

3.4.4 DNA片段的凝胶回收(QIAquickgel Extraction Kit)

3.4.5 待克隆PCR片段与pGEM—Teasy的连接及转化(与第二章相同)

3.4.6 质粒的大量提取和纯化

3.4.7 质粒DNA的酶切

3.4.8 DNA的连接

3.4.9 融合蛋白的表达

3.4.10 蛋白SDS—PAGE电泳检测

3.4.11 大肠杆菌重组蛋白的Western印迹

3.4.12 SrPCS1抗体的制备、纯化与效价检测

3.4.13 MBP—SrPCSs融合蛋白的纯化

3.4.14 蛋白质含量的测定(Bradford法)

3.4.15 重组MBP—SrPCSs融合蛋白酶活性分析

3.5 实验结果

3.5.1 SrPCSs氨基酸序列比较分析

3.5.2 SrPCSs与其它PCSs氨基酸序列比较

3.5.3 SrPCSs的三维结构模型

3.5.4 大肠杆菌GST—SrPCSs融合表达载体的构建及鉴定

3.5.5 融合蛋白GST—SrPCS的表达

3.5.6 兔抗SrPCS1免疫血清的获得及其效价测定

3.5.7 抗体的初步纯化

3.5.8 His—SrPCS融合蛋白表达载体的构建及鉴定

3.5.9 His—SrPCS融合蛋白的表达及检测

3.5.10 MBP—SrPCS融合表达蛋白载体的构建及鉴定

3.5.11 MBP—SrPCS融合蛋白的表达

3.5.12 MBP—SrPCS融合蛋白的纯化

3.5.13 重组MBP—SrPCSs融合蛋白的酶活性分析

3.6 讨论

第4章 表达SrPCS酵母的重金属抗性分析

4.1 前言

4.2 材料与试剂(本章所用到的试剂和溶液与前面相同的见相应章节)

4.2.1 材料

4.2.2 主要试剂

4.2.3 培养基的配制

4.2.4 溶液配制

4.3 主要仪器(见前面章节)

4.4 实验方法(本章所用到而在此处没有列出的方法参见前面有关章节)

4.4.1 引物设计

4.4.2 PCR反应

4.4.3 酵母细胞感受态的制备及转化(参见pVES2说明书)

4.4.4 酵母质粒的提取(Ausubel et al.,1990)

4.4.5 表达SrPCS酵母的重金属抗性实验

4.5 实验结果

4.5.1 含SrPCS cDNAs酵母表达载体的构建

4.5.2 酿酒酵母INVSc1的转化与筛选

4.5.3 表达SrPCSs的酵母在含有不同重金属诱导平板上的生长情况

4.5.4 表达SrPCSs的酵母在含有不同浓度Cd2+的诱导平板上的生长情况

4.5.5 表达SrPCSs的酵母在含有200μM Cd2+的液体诱导培养基中的生长曲线

4.5.6 表达SrPCS1、SrPCS3的酵母在含有不同Cd2+的诱导培养基上的生长曲线

4.5.7 表达SrPCS1，SrPCS3的酵母在含有不同浓度CA2+的非诱导培养基中的生长曲线

4.6 讨论

第5章 利用转基因烟草探索SrPCS的功能

5.1 前言

5.2 材料与试剂(本章所用到与前面相同的试剂和溶液及培养见相应章节)

5.2.1 材料

5.2.2 主要试剂

5.2.3 常用缓冲液和试剂的成分及配制

5.2.4 培养基的配制

5.3 主要仪器

5.4 实验方法(本章所用到而没有列出的方法参见前面的章节)

5.4.1 DNA片段的去磷酸化

5.4.2 农杆菌感受态细胞的制备与冻融法转化

5.4.3 农杆菌感受态细胞制备及电击法转化

5.4.4 农杆菌质粒的小量提取

5.4.5 农杆菌介导法转化烟草

5.4.6 转基因烟草的PCR鉴定

5.4.7 转SrPCS1—4基因烟草的重金属抗性分析

5.5 实验结果

5.5.1 超量表达SrPCSs的植物表达载体的构建及鉴定

5.5.2 转基因烟草的再生

5.5.3 T0代转基因烟草植株的northern blot检测

5.5.4 T1代转基因烟草在含有不同浓度Cd2+的培养基上的生长情况

5.5.5 T1代转基因烟草在含有不同浓度Cd2++250 μM GSH的培养基上的生长情况

5.5.6 T1代转基因烟草不同部位Cd2+含量分析

5.6 讨论

第6章 结论与展望

参考文献

附 录

致谢