兔房颤模型中TGF-β/Smad7的表达及氯沙坦的抗重塑机制研究

摘要

研究背景： 心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常之一；是缺血性脑卒中的主要病因。资料显示，随着年龄的增加房颤的患病率也随之升高，50.59岁人群的患病率为0.5％，而80岁以上的则上升为7.5％。中国男性房颤总发牛率约0.9％，略高于女性的0.7％。中华医学会心血管病学分会组织于1999年到2001年在中国内地41家医院对9297例诊断为房颤的患者进行了回顾性的调查分析，对其病因及相关危险因素研究，结果显示：老年55.1％，高血压病40.3％，冠心病34.8％，心哀33.1％，风湿性瓣膜病23.9％，特发性房颤7.4％，心肌病5.4％，糖尿病4.1％，提示老年人患高血压时房颤的发病率明显增加。专家预计在未来的50年内，房颤的发病率会增加一倍。 心房颤动的发生发展过程中，心房重塑贯穿其全过程，心房重塑包括结构重塑和电重塑。心房结构重塑表现为心房肌细胞肥大、溶解、细胞核数量和大小的改变以及间质的纤维化。电重塑以心肌活动过程各离子通道的异常为基础，表现为心房有效不应期缩短，隐匿性心房传导功能低下、心房内电传导不均一。延缓甚至逆转心房重塑可能是防治房颤的重要靶标。 Ausma等通过起搏羊的右心房建立动物房颤模型，结果发现：起搏1-2周时，心房肌细胞内出现钙超载，之后胞内Ca2+浓度逐渐下降，第4周出现新的钙平衡，16周时Ca2+浓度降低41，8％，Ca2+浓度下降的同时伴随L-型钙通道的β亚基mRNA的表达下降。电起搏刺激后，交感神经兴奋，肾上腺素、血管紧张素等升高，心房肌细胞膜表面的钙离子通道被激活，胞外的Ca2+经钙通道大量内流，导致细胞内出现钙超载。这种钙超载诱发机体反馈性下调L-型钙通道蛋白，减少L-型钙通道电流(ICa,L)，Ica,L的减少导致细胞复极加快，平台期时间缩短，从而引起动作电位及心房有效不应期缩短。提示房颤的电生理异常与心房肌离子通道异常密切关系。研究发现，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与心肌纤维化的关系密切。房颤发生过程的病理情况下，肾素．血管紧张素系统(RAS)的激活导致AngⅡ增多。AngⅡ特异性结合成纤维细胞表面G蛋白偶联的AT1受体，引起细胞内磷酸脂酶的活化而激活胞内多条信号通路，启动了心房重塑。Shi等用充血性心力衰竭诱发房颤建立犬的房颤模型，给与依那普利进行干预，起搏5周后，与对照组比较，依那普利明显减轻了心肌问质胶原的沉积从而抑制了心房肌的重塑。临床上阻断AngⅡ的合成或拮抗其与AT1受体结合治疗房颤已开始受到医学界的重视。本研究通过对心房进行快速电起搏建立的慢性房颤模型，采用AT1受体阻断，进一步加深对心房纤维化、RAS激活、心房重塑以及它们之间关系的分子生物学机制研究。 TGF-β1是重要的促纤维化细胞因子之一。TGF-β1/Smads通路在心肌重塑的发生、发展中的机制日益受重视。AngⅡ引起心肌纤维化的一个可能机制是通过TGF-β1起作用的。TGF-β1已被证明能够促进心脏成纤维细胞增殖及转变为肌成纤维细胞，接着进一步诱导这两种细胞产生大量的细胞外基质，如胶原纤维，纤维粘连蛋白等，从而促进心肌纤维化。Campbel等研究证实，AngⅡ刺激体外培养的心脏成纤维细胞后，TGF-β1的表达增加，而加入TGF-β1的中和抗体后可减少Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。Sun等也证实AngⅡ可刺激成纤维细胞的TGF-β1以无活性的形式释放后被激活，再作用于成纤维细胞，促进其分化和增生，上调胶原合成并抑制胶原酶的释放。虽然在其它心脏疾病中TGF-β1的研究较多，但其在房颤心房纤维化的作用研究仍然很少。因此，TGF-β1在房颤心房中的表达规律有待进一步探讨。 TGF-β1刺激诱发的信号转导丰要由Smad7进行负反馈调节。活化的TGF-β1 Ⅰ型受体磷酸化R-Smads，启动了TGF-β1信号转导，同时也激活了Smad7。Smad7抑制TGF-β1信号转导主要通过多方面起作用。Dooley等的研究显示：高表达的Smad7可抑制TGF-β1诱导的Smad2/3的磷酸化及其核内转移，并伴随胶原蛋白表达的减少。由于Smad2或Smad3的活化对于TGF-β1信号传导至关重要，因此对其磷酸化的抑制证明Smad7对TGF-β1信号传导的具有负调控作用。正常生理状态下，Smad7基础水平的表达能抑制R-Smads介导TGF-β1的效应，当病理性TGF-β1表达持续升高时，Smad7的表达不足以抑制TGF-β1介导的信号转导时，则会发生纤维化的病理反应。目前对Smad7在生理状态下的自稳功能虽有初步的了解，但在房颤病理情况下，其表达规律如何?作用途径如何?将是本研究的另一切入点。 目的： 1.探讨房颤发牛过程中心房肌的结构重塑和电重塑的程度与表现。 2.探讨氯沙坦改善心房重塑的有效性。 3.探讨TGF-β1和smad7是否介导了氯沙坦对心肌纤维化的作用。 方法： 健康雄性新西兰大白兔(2.0+/-0.5kg，雄性)48只随机分成6组，每组各8只：正常组(Group N)；假手术组(Group S)；快速起搏组(Group P)；快速起搏+losartan(10mg/kg per day)(Group D1)；快速起搏+losartan(20mg/kg per day)(Group D2)；快速起搏+losartan(30mg/kg per day)(Group D3)。给家兔左心房心外膜电起搏，以1000次/分钟高频不间断起搏4周，建立慢性房颤模型；分别于起搏前及起搏过程的1、3，5，7、14、21，28天录取心电图；起搏前和起搏后行心外膜程序性起搏，观察诱发心房颤动的情况，并测定心房有效不应期(AERP)。药物干预组于起搏的同时用losartan灌胃家兔4周，4周后取家兔心房组织，用Masson染色显示心房组织的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，用放射免疫的方法测定家兔左心房组织中AngⅡ的含量；心肌羟脯氨酸含量的测定采用氯胺T法。用RT-PCR测定FGF-β1，Smad7的mRNA水平，用westem-blot测定TGF-β1，Smad7的蛋白水平。各实验数据为实验重复3次的平均值，以均数±标准差表示。用spss11.0统计软什，以配对t-test分析组内的差异，以One-way ANOVA分析各组别之间的差异，各组间的比较采用SNK检验，相关分析采用Pearson直线相关。 结果： 1.Group P，Group D1、2、3各组的心房组织的AngⅡ浓度均高于正常家兔，差异有统计学意义，Group D1、2、3给予Losartan灌胃4周后，AngⅡ的浓度较Group P稍高，但差异没有显著性。 2.分别用200ms、160ms、120ms三个起搏周长对家兔左心房进行程序起搏，测定心房有效不应期(ERPA)。Group P起搏后的ERPA较起搏前明显缩短；与Group P相比Losartan干预的Group D1、2、3的ERPA明显延长，差异有统计学意义，且随着Losartan剂量越大，ERPA延长越明显。 3.起搏家兔的左房重量、左房重量指数明显高于正常家兔；与Group P比较，Group D1、2、3的左房重量、左房重量指数显著减少，提示Losartan减缓了左房纤维化。 4.与正常家兔相比，起搏家兔出现明显的心肌纤维化，左心房心肌间质Ⅰ型和Ⅲ型胶原明显增多；Losartan干预4周后，Group D1、2、3的左心房心肌间质胶原显著减少；同时羟脯氨酸含量也明显降低，表明Losartan抑制了Ⅰ型、Ⅲ型胶及羟脯氨酸的形成。 5.分别采用RT-PCR和Westem-Blot检测心肌组织的TGF-β1和Smad7 mRNA和蛋白的表达水平。所有起搏家兔的TGF-β1的表达明显高于正常组、Smad7的表达明显低于正常组。与Group P比较，Group D1、2、3的TGF-β1的表达水平明显降低，而Smad7表达水平却明显升高。 6.在房颤组中，心肌纤维化与TGF-β1、Smad7的表达密切相关(P＜0.01)，其中与TGF-β1呈正相关(RE=0.7636，P＜0.01)，与Smad7呈负相关(R2=-0.8648，P＜0.01)；LAMI与羟脯氨酸的含量呈正相关(R2=0.857，P＜0.01)，结果提示心肌纤维化与TGF-β1/Smad7信号通路相关。 结论： 1.与正常家兔比较，起搏组家兔的心房组织存在明显的心肌纤维化，表现为左心房重量指数、胶原纤维的含量和羟脯氨酸含量的增加；伴随着组织重塑的同时，心房有效不应期的缩短是本组实验动物经历电重塑后的主要电生理异常。 2.实验家兔纤维化的心肌中伴随着TGF-β1表达上调、Smad7表达下调。 3.Losartan延缓了心肌纤维化，改善了起搏家兔的心房重塑；Losartan延缓心肌纤维化的作用可能与阻断AT1受体后下调TGF-β1表达，上调Smad7的表达有关。

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