应用SELDI-TOF-MS技术筛选两种小鼠放射性肺损伤血清差异性蛋白质波谱

摘要

背景：放射治疗在肺癌、乳腺癌、食管癌、纵隔肿瘤等胸部肿瘤的综合治疗中有重要地位：以肺癌为例，所有肺癌患者中的61.0％在其病程某个时间点需要接受放射治疗。对不可手术的ⅢA期及ⅢB期非小细胞肺癌，同期放化疗是目前标准治疗模式；对局限期小细胞肺癌，放疗可以提高局控率及总生存率。而放射性肺损伤是肺癌等胸部肿瘤放射治疗中的主要剂量限制性毒性，据统计，接受胸部放疗的肺癌患者中，5％～20％在放疗后发生严重的放射性肺损伤，直接影响患者生存质量，2.3％的患者死于放射性肺损伤。放射肿瘤学家们为预测放射性肺损伤的发生从而个体化地指导放疗做了大量研究工作，建立了一些物理模型如双肺V20、平均肺剂量(MLD)、NTCP模型以及寻找了一些生物标志物如转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管紧张素(ACE)等，其中TGF-β是学者们研究得最多的生物标志物之一。但在临床应用中发现，以双肺V20为参考，有些患者接受了安全域值内的照射，但也发生了Ⅲ～Ⅳ度的放射性肺炎，而另一些患者受照明显超出安全域值，放射性肺炎却轻微。单纯基于物理参数的NTCP模型不可能适用于所有患者。因此，寻找有效的生物标记物，并将其与NTCP模型联用，就有可能使肺损伤的预测更为个体化。随着人类基因组图谱绘制完成，生命科学的研究已经进入后基因组时代。蛋白质是生命功能的具体执行者，机体的生理及病理状态在蛋白质水平均有所体现。蛋白质组学研究已经成为后基因组时代研究的热门话题。 目的：筛选两种对放射性肺损伤敏感性不同的小鼠胸部照射后随时间变化的血清差异性蛋白质波谱。 材料与方法：成年雄性SPF(specmc pathogen free)级C57BL/6J小鼠及C3H/He小鼠各32只，体重范围18g-22g，PBS-Ⅱc型表面增强激光解吸附电离-飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization tirne-of-flight mass spectrometry，SEL,DI-TOF-MS)系统、弱阳离子交换(weak cation exchange，WCX2)芯片CM10和能量吸收分子CHCA购于美国Ciphergen公司。用完全随机化设计法，将两种品系各32只小鼠分别随机分为A～H组(分别代表照射后0小时，1天，3天，1周，2周，4周，9周及假照射处死取标本组)。每两只小鼠同时照射，照射剂量8Gy/1F。如为照射后需立即取标本(0小时组)则每次照射1只小鼠。假照射组小鼠经过与其他组小鼠相同的照射准备工作，而没有真正接受照射，随后立即取标本作为对照组。两种品系试验组小鼠各7组，分别于照射后相应时间麻醉下以1ml注射器针头直接从小鼠心脏取血，收集血清，-80℃冰箱保存，左肺取出后冻存于-80℃冰箱，经石蜡包埋、切片，HE及Masson’ trichrome染色后于光学显微镜下观察病理组织学变化。蛋白芯片采用蛋白质芯片阅读机(PBS Ⅱc型)读取数据。采用Ciphergen proteinchip3.02自动采集数据，应用浙江大学肿瘤研究所设计的ZUI-ProteinChip Data Analyze System软件包分析所得数据，各组小鼠血清的蛋白质谱差异采用Biomarker Wizard分析。数据进行统计处理采用Ciphergen proteinchip 3.02分析软件，组间蛋白峰比较采用Student's t检验，确定组间P＜0.05时具有统计学意义。 结果：小鼠照射从第4周起可观察到小鼠胸部照射处皮肤毛色变白并逐渐脱毛，尤其以C57BL/6J小鼠明显。两种小鼠肺组织切片后，进行形态学观察，C3H/He小鼠切片组织经HE染色，主要表现为随时间发展，血管腔呈现先扩张充血，2周后恢复至基本正常；肺泡腔先有较多渗出物，1周后逐渐吸收；肺泡间隔增宽，肺间质炎细胞浸润逐渐增多；经Masson’s trichrome染色，主要表现为较大的血管和支气管壁见蓝染物质，从1周开始，部分肺泡间隔及小血管、小支气管出现少许淡蓝染色物质，到第9周时，肺泡间隔中未见明显增加的淡蓝染色物质。C57BL/6J经HE染色，表现为随时间发展，血管腔呈先增生扩张充血，4周后逐渐恢复至大致正常；肺泡腔先有较多渗出物，1周后逐渐吸收；肺泡间隔渐增宽，肺间质炎细胞浸润逐渐增多，肺泡结构紊乱，部分肺泡间隔断裂；经Masson's trichrome染色，仍然主要表现为较大的血管和支气管壁见蓝染物质，从1周时开始局部肺泡间隔及部分小血管开始呈现淡蓝染色物质，且呈现逐渐增多的趋势。C3H/He小鼠和C57BL/6J小鼠中分别发现36种和49种差异性蛋白质峰。其中有统计学意义的分别有8种和31种。在C3H/He小鼠中表达随时间推移呈下降趋势的有质荷比(mass-to-chargeratio，m/z)为：9298.85的蛋白质峰；随时间推移呈升高趋势的有：m/z 4686.05、7608.96、7853.34、7958.67、15900.4和30638.5；呈先下降后升高趋势的有：m/z 2105.97。在C57BL/6J小鼠中表达的蛋白质峰随时间推移呈下降趋势的有：m/z 9288.35；随时间推移呈升高趋势的有：m/z3583.55、14806.1；呈先下降，后升高趋势的有：m/z4123.04、4326.1、4414.40、8721.08；呈“降-升-降”趋势的有：m/z3568.62、4307.79、4876.77、4995.56，5021.8，5207.69，7512.33，7805.93，7909.43，14961.9，15171.2，15595.9，15805、23651.3、29890.1、30533.5、31151.2、46080，呈“升-降-升”趋势的有：m/z 4179.45、4906.66、5822.87、11632.8、32965.3、65783.1。 结论：SELDI-TOF-MS技术初步筛选出了胸部放射后C3H/He小鼠与C57BL/6J小鼠随时间推移而变化的血清差异蛋白质，从蛋白质组学的角度证实了这两种小鼠放射性肺损伤敏感性的不同。但其功能尚不明确，有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

第2澡研究目的

第3章材料与方法

第4章结果

第5章讨论

第6章结论

参考文献

附图及附表

致 谢