斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究

摘要

杆状病毒感染昆虫细胞可诱导细胞凋亡(apoptosis)，细胞凋亡作为一种宿主范围决定因子限制了杆状病毒的杀虫范围，影响杆状病毒杀虫剂在生物防治中的应用：然而，在长期进化过程中，杆状病毒获得了抗凋亡基因以阻止细胞凋亡，使其能够正常复制。在已测序的杆状病毒中绝大部分都包含两个或两个以上的抗凋亡基因，但是部分体外实验结果表明，并不是所有抗凋亡基因都具有抗细胞凋亡活性。本研究首次利用RN Ai技术对斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)中两个抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受纳宿主中的抗凋亡功能进行研究，通过瞬时表达检测探讨两个基因在SpltNPV非受纳宿主中的抗凋亡功能，同时对抗凋亡基因与其宿主的进化关系进行了初步探讨。主要结果如下： PCR扩增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因，分别将其连接到含有两个反向T7启动子的质粒载体上，体外转录得到大片段的双链RNA (double strain RNA，dsRNA)，将dsRNA分别或同时转染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221细胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49，或者同时沉默Splt-iap4和Splt-p49的转录。经光学显微镜观察、DNA ladder检测、细胞存活率计算以及病毒滴度测定，结果说明SpltNPV感染SpLi-221细胞时，Splt-P49具有抗凋亡功能，而Splt-IAP不具有这种功能。但实验中发现，SpltNPV感染SpLi-221细胞在48 h之前细胞会聚集成团，而勋Splt-iap4dsgNA处理细胞未出现此现象，大部分依然是独立的单个细胞，推断Splt-lap4基因在病毒感染期间起到了某种作用使得细胞的聚集受阻，但Splt-iap4的功能与病毒产生可感染性的子代病毒无关。 在vAcAnh感染Sf9系统中，分别瞬时表达Splt-iap4和Splt-p49两基因，经光学显微镜和细胞存活率计算方法检测，结果同样显示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能，且Splt-IAP无辅助抗凋亡功能或延迟细胞凋亡功能。最后对杆状病毒中的抗凋亡基因与其来源宿主进行进化分析，结果显示亲缘关系相近的杆状病毒所含的抗凋亡类型也相近，说明抗凋亡基因与杆状病毒进化有着密切的关系，也可能发挥着重要作用。 斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(S. exigua)同属夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾属的昆虫，亲缘关系很近．且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)基因组相似性很高，但这两种病毒并不能交叉感染各自宿主。本文从细胞水平和亚显微水平对SpltNPV感染非受纳宿主离体细胞Se301的过程进行了描述，并对感染失败的原因进行了初步的生化分析。 光学显微镜显示，被SpltNPV感染的Se301细胞在感染后24 h至120 h期间细胞出现了明显的病理现象，包括细胞空泡，细胞聚集等，且随着时间的延长病理症状越来越严重，但感染细胞中始终没有病毒多角体。DAPI染色荧光观察和电镜观察结果，都表明从24 h至120 h各样品中均显示细胞出现了早期凋亡的特征，但未形成晚期凋亡特征的凋亡小体。TCID50检测表明病毒没有产生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting显示，在被感染的Se301细胞中可完成病毒DNA的复制；RT-PCR分析也显示，感染细胞72 h时，SpltNPV的早、晚期基因都有转录；Western blotting没有检测到被感染细胞中有极晚期基因polyhedrin的表达。以上结果表明，SpltNPV的感染可导致Se301细胞出现明显的早期凋亡症状，但不能进行到凋亡的最后阶段：虽然病毒可完成DNA的复制且早、晚期基因均有转录，但病毒的感染不能发展至极晚期，说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。

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声明

前言

第一章杆状病毒诱导的细胞凋亡及RNAi技术(文献综述)

1.1核多角体病毒

1.2杆状病毒感染和宿主的关系

1.3杆状病毒宿主专一性

1.4细胞凋亡概念及其形态学特征

1.5细胞凋亡与细胞坏死区别

1.6细胞凋亡的分子机制

1.7杆状病毒感染引起的细胞凋亡研究

1.8抗凋亡基因

1.8.1 p35基因

1.8.2 p49基因

1.8.3 iap基因

1.9 RNAi技术

1.9.1 RNAi的发现与发展

1.9.2 RNAi作用机制

1.9.3 RNAi机制中的主要成员

1.9.4用RNAi方法研究特定基因功能的技术路线

第二章 Splt-iap4和Splt-p49基因转录和翻译研究

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1 Splt-iap4转录时相

2.2.2 Splt-p49转录时相

2.2.3 Splt-iap4表达时相

2.2.4 Splt-p4表达时相

2.3 讨论

2.4小结

第三章应用RNAi技术研究Splt-iap4和Splt-p49基因功能

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果

3.2.1 Splt-iap4和Splt-p49基因的PCR扩增

3.2.2对照cat基因的PCR扩增结果

3.2.3重组质粒p28i-p49和p28i-iap4酶切鉴定

3.2.4重组质粒p28i-cat酶切鉴定

3.2.5 Splt-p49和Splt-iap4凋亡功能检测

3.2.6 Splt-IAP4蛋白没有协同抗凋亡作用

3.2.7 Spit-lAP4对细胞有聚集作用

3.2.8 Splt-iap4 dsRNA处理对产生感染性病毒粒子的影响

3.2.9 RNAi对SpltNPV感染SpLi-221细胞的影响

3.3讨论

3.4小结

第四章SpltNPV iap4和p49瞬时表达及抗细胞凋亡活性研究

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1瞬时表达载体的构建

4.2.2瞬时表达蛋白检测

4.2.3 Splt-IAP4和Spit-P49抗凋亡活性检测

4.3讨论

4.4小结

第五章杆状病毒与抗凋亡基因的进化关系研究

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与分析

5.2.1 43株杆状病毒全基因组特征

5.2.2 43株杆状病毒全基因组中的抗凋亡基因

5.2.3 iap的序列比对和进化分析

5.3讨论

5.4小结

第六章SpltNPV感染诱导Se301细胞凋亡的检测与分析

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2方法

6.2结果与分析

6.2.1光镜显微观察SpltNPV感染Se301细胞的形态学变化

6.2.2电子显微镜观察SpltNPV感染Se301细胞的形态学变化

6.2.3 DAPI染色

6.2.4 Trypan blue染色

6.2.5 DNA ladder

6.2.6滴度测定

6.2.7 Dot blotting

6.2.8 RT-PCR

6.2.9 SDS-PAGE和Western blotting分析

6.3讨论

6.4小结

总结

参考文献

在读期间发表的论文

国内外会议论文摘要

致谢