研究背景和目的： 结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的严重威胁人类健康的以呼吸道系统为主的慢性传染病。据估计，全球近20亿人感染了肺结核，占全球人口的三分之一，其中有2千万人患活动性肺结核。全世界每年新发病人1千万人，而每年死于结核病的患者则高达300万人。我国是全球22个高负担防治结核病的国家和地区之一，感染率仅次于印度，估计绝对人数超过印度。MTB属于胞内感染菌，免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞识别抗原受到主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)的限制，人类的MHC称人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)。CD4+T细胞特异性的识别MHC Class Ⅱ类分子递呈的抗原肽，CD8+T细胞特异性的识别MHC Class Ⅰ类分子递呈的抗原肽。 T细胞是通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别靶细胞或抗原递呈细胞表面MHC分子结合的特异性肽表位复合体，但这种特异性识别亲和力低，即速便发生解离。构建多聚体肽／MHC复合体可提高其与TCR的亲合力，延缓二者的解离速率，为抗原特异性T细胞检测提供了可能性。1996年Altman等利用基因工程技术在MHC-Ⅰ类分子α链的C端加上一段生物素标记序列，构建MHC重组分子；通过大肠埃希菌表达MHC-Ⅰα链重组分子的融合蛋白，将其与β2m和抗原肽进行体外折叠，形成MHC-肽复合物；在BirA酶(生物素化酶)作用下，MHC-肽复合物被生物素标记；生物素标记MHC-肽复合物与荧光素标记的链霉亲和素以4：1比例混合，即得到荧光标记的四聚体。MHC-肽四聚体自被制作成功后，即被用于多种免疫应答的T细胞研究中。制备出的MHC类蛋白必须在BirA酶的催化作用下，使底物肽(BSP)中的赖氨酸残基生物酰化并和外源性的生物素连接，完成生物素化后与链霉亲和素结合形成四聚体。体外生物素化需要购买昂贵的BirA酶，而且程序繁琐，在一系列的更换缓冲液和蛋白浓缩过程中存在严重的蛋白丢失。我们的目的是从大肠埃希菌KW12中扩增BirA目的基因，PCR产物连接至pGEM-T Easy载体，并测序鉴定，将测序正确的DNA片段亚克隆到果蝇表达载体pMT／Bip／HisV5-A Vector中；利用酶切及PCR方法鉴定重组质粒，并测序鉴定，测序无误的重组表达质粒与MTB多肽／HLA Class Ⅱα链重组表达质粒、β链重组表达质粒以及药物筛选质粒共转染S2果蝇表达系统(Drosophila expression system，DES)，通过药物筛选获得高效表达可溶性的MTB多肽／HLA Class Ⅱ复合物和BirA酶的S2恒定细胞株，诱导后取上清用Dot-blotting和Western-blotting方法鉴定BirA蛋白表达结果及其生物素化功能。探索是否能够利用MTB多肽／HLA Class Ⅱ与BirA酶在昆虫细胞共转染系统实现共表达与生物素化一步完成，以解决BirA酶购买困难、简化生物素化过程并降低试验耗费等问题，用于本课题组之后的四聚体构建及其他研究。 研究内容和方法： 按GenBank中登录的大肠埃希菌K-12MG1655的BirA基因DNA序列和克隆表达载体pMT／Bip／HisV5-A Vector多克隆位点设计3条引物：5'primer、3’①primer(含终止密码子)、3’②primer(不含终止密码子)。煮沸法从E.coli KW12的饱和菌液中制备BirA酶基因模板，PCR方法获得BirA①和BirA②基因，获得的PCR产物回收后，克隆到pGEM T-easy载体构建克隆载体，转化感受态DH5a后挑取阳性克隆委托公司测序。测序结果登陆GenBank进行比对无误后，用对应引物的限制性内切酶对阳性克隆质粒和表达载体pMT／Bip／HisV5-A Vector分别进行双酶切后连接，转化后挑取阳性亚克隆委托公司测序，测序结果登陆GenBank进行比对无误后，用磷酸钙方法与MTB多肽／HLA Class Ⅱα链重组表达质粒、β链重组表达质粒以及药物筛选质粒共转染S2果蝇表达系统DES，通过药物筛获得能高效表达可溶性的MTB多肽／HLA Class Ⅱ复合物和BirA酶的S2恒定细胞株，CuSO4诱导后取上清用Dot-blotting和Western-blotting方法鉴定BirA蛋白表达结果及其生物素化功能。 结果： 从大肠埃希菌KW12中扩增的BirA基因约1KB的片断，经过克隆到pGEMT-easy载体和亚克隆到pMT／Bip／HisV5-A Vector测序结果均与GenBank中登录的大肠埃希菌K-12MG1655的BirA基因DNA序列一致。BirA酶与MTB多肽／HLA Class Ⅱ共转染S2果蝇昆虫细胞表达产物的Dot-Blotting检测结果显示：BirA酶、MTB多肽／HLA Class Ⅱα链(V5抗体)、β链、αβ二聚体均检测到表达，并且可检测到MTB多肽／HLA Class Ⅱ被生物素化(标记上生物素)。Western-blotting结果再次印证了MTB多肽／HLA Class Ⅱα链(V5抗体)、β链、αβ二聚体的表达，MTB多肽／HLA Class Ⅱ被生物素化，MTB多肽／HLA Class Ⅱα链50KD左右，β链35KD左右，在94KD与66.2KD之间可见模糊条带大约80KD左右，考虑可能是变性不完全的αβ二聚体，和35KD左右的BirA酶。 结论： 建立的果蝇表达系统DES包含表达载体(pMT／BiP／HisV5-A Vector)和相应的选择载体(pCoHygro)。通过表达载体和选择载体的共转染，可在3～4周时间内获得表达重组蛋白的稳定转染的细胞系。而且通过优化表达载体和选择载体的比例，可以得到含有高拷贝数目的基因的细胞系，从而提高目的蛋白的表达量，并且可获得模拟天然的MTB多肽／HLA Class Ⅱαβ二聚体的表达产物。利用MTB多肽／HLA Class Ⅱ与BirA酶在昆虫细胞内共转染实现表达与生物素化一步完成，可以解决BirA酶购买困难、简化生物素化过程并降低试验耗费等问题，用于本课题组之后的四聚体构建及其他研究。 问题： 目前存在的问题是虽然试验结果最后检测到BirA酶表达成功，并且成功生物素化MTB多肽／HLA Class Ⅱ，但尚待进一步构建四聚体并检测其功能。已有一篇文献[1]表明多肽／HLA Class Ⅱ与BirA酶基因共转染细胞可成功生物素化并构建成有功能的四聚体。现细胞已大量扩增，准备大量纯化蛋白制备四聚体，预期本课题通过努力可成功构建有功能的四聚体，为本课题组将来大量构建各种四聚体打下坚实的基础。
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