灵长类动物CD4CD25Foxp3调节性T细胞与Vγ2Vδ2T细胞相互调节作用的实验研究

摘要

第一部分灵长类动物Vγ2Vδ2T细胞对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞调节作用的体外实验研究 目的： 探讨灵长类动物Vγ2Vδ2T细胞对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+regulatoryTcells，Tregs)的体外负调节作用，为寻求利用激活/扩增的Tregs和/或Vγ2Vδ2T细胞作为潜在的免疫治疗工具提供相关理论依据。 方法： 抽取7只新购得的没有潜伏感染的正常短尾猴(Cynomolgusmacaques，CN)或中国猕猴(Rhesusmacaques，RH)外周血，并分离外周血淋巴细胞(Peripheralbloodlymphocytes，PBLs)。分别单独应用不同终浓度(10U/mL、20U/mL、40U/mL、80U/mL、120U/mL、160U/mL)的白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)或联合应用终浓度为40ng/mL的磷酸化抗原HMBPP((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl，diphosphate，HMBPP)，对分离的PBLs进行体外刺激培养，进而采用流式细胞术在单个细胞水平上检测PBLs中的Tregs和Vγ2Vδ2T细胞对IL-2和/或HMBPP刺激的反应。 结果： 各种浓度IL-2单独处理组的Tregs都有不同程度的显著扩增(与空白对照组、HMBPP单独处理组、及相应浓度IL-2(160U/mL除外)联合HMBPP处理组相比，P<0.05)，而Vγ2Vδ2T细胞只有轻微扩增(与空白对照组、HMBPP单独处理组相比，P<0.05)。各种浓度IL-2联合HMBPP处理组的Vγ2Vδ2T细胞显著扩增(与空白对照组、HMBPP单独处理组、及相应浓度IL-2单独处理组相比，P<0.001)。各种浓度IL-2联合HMBPP处理组的Tregs的扩增与空白对照组及HMBPP单独处理组相比有显著上升(P<0.01)，但与相应浓度IL-2(160U/mL除外)单独处理组相比，则有明显下降(P<0.05)。 结论： 联合应用IL-2和磷酸化抗原HMBPP引起的灵长类动物外周血中的Vγ2Vδ2T细胞的体外特异性扩增，显著性限制IL-2单独应用引起的CD4+CD25+Foxp3+Tregs的体外扩增，表明IL-2联合磷酸化抗原激活的Vγ2Vδ2T细胞对单独IL-2激活的Tregs有体外下调作用。 第二部分体内研究灵长类动物Vγ2Vδ2T细胞对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在BCG感染过程中的调节作用 目的： 通过对感染结核分枝杆菌卡介苗(MycobacteriumbovisbacilleCalmette-Gue'rin，BCG)的灵长类动物动物模型体内注射合成的磷酸化抗原--Picostim(HydroxyDimethylAllylPyroPhosphonate，HDMAPP；商品名：Picostim)/HMBPP和/或IL-2，试图阐明在BCG感染过程中，灵长类动物Tregs和Vγ2Vδ2T细胞之间可能存在的的体内相互调节作用，为寻求利用IL-2和/或磷酸化抗原激活的Tregs和Vγ2Vδ2T细胞作为潜在的调控人类结核分枝杆菌感染的免疫治疗工具提供相关理论依据。 方法： 对29只新购得的没有潜伏感染的短尾猴或中国猕猴，按照BCG组(7只)、BCG+Picostim组(4只)、BCG+IL-2组(6只)、BCG+IL-2+Picostim组(7只)、IL-2+HMBPP组(5只)进行随机分组并给予相应不同的处理因素，分别在第0、4、7、14、21、28、42、70天各时间点抽取每只实验动物5～15mlEDTA抗凝的外周血液样本，采用流式细胞术在单个细胞水平上检测不同处理因素对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞和Vγ2Vδ2T细胞表型和数量的影响。 结果： 1.与BCG组和BCG+Picostim组没有注射IL-2的实验组相比，BCG+IL-2实验组动物外周血中的CD4+CD25+Foxp3+T细胞的频率和绝对数量在第7天和第14天时显著性地增加了2～5倍(P<0.01)；CD8+CD25+Foxp3+T细胞的频率和绝对数量在第7天也有显著性增加(P<0.01)；CD4+Foxp3+Vβ3.1+T细胞和CD4+Foxp3+Vβ5a+T细胞的百分比和绝对数量在第7天也有显著性的上升(p<0.01)，而CD4+Foxp3+Vβ8a+T细胞的百分比和绝对数量没有显著性的变化。 2.BCG+Picostim实验组动物外周血中的Vγ2Vδ2T细胞没有扩增；BCG+IL-2实验组动物外周血中的Vγ2Vδ2T细胞只发生了轻微扩增；BCG实验组动物外周血中的Vγ2Vδ2T细胞在感染早期没有扩增，在第21天时有了明显扩增(与BCG+Picostim和BCG+IL-2实验组相比，P<0.05)。经过1.0MIU/天低剂量的重组人IL-2联合Picostim/HMBPP注射的两组实验动物，与其他三组相比，外周血中的Vγ2Vδ2T细胞则发生了显著性的扩增(第4、7、14天：P<0.001)。 3.IL-2联合Picostirn/HMBPP注射的两组实验动物外周血中的Vγ2Vδ2T细胞显著激活/扩增，而这两组实验动物外周血中的Tregs和选择性的TCRVβ的扩增与BCG+IL-2实验组相比，则显著下降(第7天：p<0.001；第14天：p<0.01)。 结论： 1.外源性IL-2能体内诱导灵长类动物BCG感染过程中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞发生显著扩增；IL-2联合磷酸化抗原Picostim/HMBPP能体内特异性诱导其Vγ2Vδ2T细胞发生显著扩增；IL-2联合Picostim/HMBPP体内注射引起的Vγ2Vδ2T细胞的特异性扩增能够抑制IL-2单独注射诱导的Tregs细胞的扩增。这些体内结果表明，Vγ2Vδ2T细胞可能通过竞争利用IL-2的机制，对Tregs有体内负调节作用。 2.BCG+IL-2实验组与BCG实验组相比，在感染第21天时缺少BCG实验组动物外周血中的Vγ2Vδ2T细胞的明显扩增，可能是IL-2激活的Tregs抑制了单独BCG感染引起的Vγ2Vδ2T细胞的明显扩增。表明外源性IL-2激活的Tregs可能存在对Vγ2Vδ2T细胞的体内负调节作用。 第三部分灵长类动物CD4+CD25+FOXp3+调节性T细胞对Vγ2Vδ2T细胞调节作用的体外实验研究 目的： 研究灵长类动物Tregs对Vγ2Vδ2T细胞的体外负调节作用，为寻求利用IL-2和/或磷酸化抗原激活的Tregs和Vγ2Vδ2T细胞作为潜在的免疫治疗工具提供相关理论依据。 方法： 1.分离6只无潜伏感染CN/RH猴子的外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclear-cells，PBMCs)，采用免疫磁珠法分别分选纯化出CD4+CD25+Tregs和Vγ2Vδ2T细胞，按不同比例混合后标记上CFSE(Carboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester，CFSE)。在IL-2的刺激下，将CFSE标记的Tregs与不同数量Vγ2Vδ2T细胞的混合物体外培养7天，用流式细胞术分别检测Tregs和Vγ2Vδ2T细胞的扩增情况。 2.分离6只感染过BCG的灵长类动物CN/RH动物模型外周血中的PBMCs，并采用免疫磁珠法分选纯化出CD4+CD25+T细胞。将不含有CD4+CD25+T细胞的剩余PBMCs标记上CFSE，然后单独或与不同数量的纯化CD4+CD25+T细胞混合，同时分组分别给予结核杆菌纯化蛋白衍生物(Purifiedproteindirive，PPD)、CD3/CD28抗体、HMBPP和/或IL-2刺激，体外培养7天，用流式细胞术检测不含或含不同数量CD4+CD25+T细胞的PBMCs中的CD4+、CD8+T细胞和Vγ2Vδ2T细胞对PPD、CD3/CD28抗体、HMBPP和/或IL-2刺激的反应。 3.从3只没有潜在感染的短尾猴的外周血中分离PBMCs，经过IL-2联合HMBPP体外刺激5天后，收集这些细胞并标记上CFSE，再加入从当天抽取的相同动物外周血新鲜分离的PBMCs中分选纯化的CD4+CD25+Tregs，在IL-2的刺激下继续培养4天。 结论： 1.IL-2刺激引起的，体外纯化的CD4+CD25+Tregs对共培养的纯化Vγ2Vδ2T细胞呈剂量依赖方式的扩增，表明Vγ2Vδ2T细胞可能是CD4+CD25+Foxp3+Tregs调节的效应细胞之一。 2.CD4+CD25+T细胞抑制CD4+、CD8+T细胞和Vγ2Vδ2T细胞的抗原特异性和非特异性扩增，并以剂量依赖方式抑制IL-2联合磷酸化抗原体外激活/扩增的Vγ2Vδ2T细胞，表明Tregs对Vγ2Vδ2T细胞有直接的体外负调节作用。 3.Tregs能够抑制IL-2联合HMBPP体外预先激活的Vγ2Vδ2T细胞的继续扩增。 4.总之，灵长类动物Tregs和Vγ2Vδ2T细胞之间具有相互调节作用，磷酸化抗原和/或IL-2是激发这种相互调节作用的关键因素之一。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词语表

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第一部分灵长类动物Vγ2Vδ2 T细胞对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞调节作用的体外实验研究

前言

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4 小结

附图1

第二部分体内研究灵长类动物Vγ2Vδ2T细胞对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的调节作用

前言

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

附图2

附图3

附图4

附图5

第三部分灵长类动物CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对Vγ2Vδ2 T细胞调节作用的体外实验研究

前言

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

附图6

附图7

附图8

附图9

附图10

附图11

参考文献

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