关于E-选择素-PSGL-1介导的流动增强型细胞滚动粘附问题的研究

摘要

流动增强型粘附受到粘附分子与环境剪切力的双重调制。揭示其中的分子反应动力学机制，对于深入了解白细胞如何在血流剪切作用下到达炎症部位，启动炎症级联反应，以及与此相关的生理和病理过程，相应抗炎、抗肿瘤等药物的设计，均具重要意义。本论文以免疫分子系统(E—选择子/PSGL-1)调控的HL—60细胞粘附为实验模型，采用流动腔实验技术手段，研究了流动增强型粘附过程中的二维反应动力学问题。主要内容包括以下三个方面： 一、对E—选择素与PSGL-1相互作用介导的流动增强型粘附的动力学机制进行了全面的研究。首先，通过加入3％右旋糖苷提高溶液粘性1.69倍，结果表明：不同粘性溶液下细胞的滚动速度与剪应力相关，而不依赖剪切率；另外，采用多聚甲醛固定细胞，发现固定前后细胞的滚动速度变化很小，由此排除了剪切率输运和细胞形变通过提高正反应速率来增强细胞滚动的可能性；其次，测定了瞬时粘附细胞的生存时间，结果表明生存时间随剪应力的单调增大呈现出先增大后减小趋势。当剪应力为0.35 dyn/c㎡时，瞬时粘附的生存时间达到最大值；进而，利用一阶解离动力学模型，对生存时间大于等于时间t的细胞数目对t作图，线性拟合得到斜率的负值：即逆反应速率(koff)。结果表明逆反应速率随剪切力的增大呈现先减小后增大的趋势。这一曲线与生存时间曲线存在互补关系，却跟滚动速度的趋势一致。最后，对由双键或多键介导的细胞滚动过程进行了滚动步态分析，用停留—行走模式定量描述了细胞的滚动行为，所用参数包括平均停留时间、平均行走时间、停留频率、停留时间比率和行走时间比率，结果表明平均停留时间作为重要的描述参数，其曲线与单键的生存时间曲线趋势一致，并与滚动的平均速度趋势相反。通过以上的分析，研究证实了E—选择素介导的流动增强型滚动粘附的逆锁键机制，即力的作用降低了分子键的解离速率，从而增加了分子键的生存时间，使细胞的滚动更稳定。 二、首次采用倒置流动腔技术，比较研究了细胞在正置和倒置方向下的滚动特性。结果表明，无论重力的作用是使粘附细胞趋向于离开还是接近流动腔的壁面，由E—选择素介导HL—60细胞的滚动粘附过程，均受到粘附分子间力—化学偶联相互作用的调控，呈现由“逆锁键”介导的流动增强型细胞粘附滚动现象；相较于沉降使细胞趋向于壁面的情形，当沉降使粘附细胞趋向于离开流动腔的壁面之时，细胞的沉降效应，不会影响剪应力阈值的大小，但将使得细胞的滚动更为稳定，延长细胞停留时间，进而降低细胞的滚动速度；偏离剪应力阈值越远，细胞沉降的效应越显著。由此显示，上述细胞沉降效应，可能源于细胞粘附事件的“沉降筛选”机制与粘附分子间力—化学偶联相互作用的动力学机制。 三、首次测定了滚动粘附细胞的解离率常数koff(RA)，用于描述重力和水动力耦合作用下细胞的解离过程。研究发现，由粘附分子介导的滚动过程，若最后的粘附键解离，新键未能形成之时，滚动细胞解离，重力沉降作用使之远离壁面并被流体带走。在其中，重力并不直接影响细胞滚动，但通过沉降作用对细胞解离起到一定的作用。流动腔在倒置方向下能防止新细胞的粘附和解离细胞的再次粘附。可测得细胞解离的时间，转换为细胞保持粘附的时间并运用一阶解离动力学模型，计算出滚动粘附细胞的解离常数，结果表明，细胞解离动力学曲线跟单键解离的逆反应速率曲线趋势一致，因此，在细胞水平进一步证实了流动增强型滚动的逆锁键机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1研究的背景和意义

1.1炎症级联反应过程

1.2参与炎症级联过程的粘附分子简介

2国内外的研究现状

2.1二维反应动力学研究的实验技术比较

2.2流动腔理论原理与工作模式

2.3流动腔系统在二维反应动力学中的应用现状

2.4 E-选择素与配体的相互作用研究

2.5流动增强型细胞粘附的最新研究进展

2.6重力对细胞滚动粘附影响的最新研究进展

3科学问题的提出和论文研究的主要内容

3.1科学问题的提出

3.2研究的主要内容

3.3论文撰写的思路

第二章材料和方法

1材料

1.1细胞和微球

1.2蛋白和抗体

1.3实验所用的主要仪器

1.4流动腔系统

2方法

2.1细胞培养

2.2流动腔的功能化

2.3流式细胞仪定量检测微球或细胞上分子的表达水平

2.4流动腔实验

第三章流动腔系统的稳定性和功能化研究

1引言

2结果

2.1流场分析结果

2.2特异性结果

2.3功能化流动腔的测定结果

2.4不同采集帧速测定的结果

3讨论

3.1流动腔系统的可行性和稳定性分析

3.2 E-选择素与PSGL-1介导细胞滚动的特异性分析

3.3流动腔功能化结果分析

4小结

第四章E-选择素介导的流动增强型细胞粘附

1引言

2实验结果与分析

2.1细胞粘附的动力学过程

2.2剪应力调控粘附细胞的滚动

2.3细胞滚动粘附中的力—化学偶联相互作用

3粘附细胞的滚动行为

3.1平均滚动速度

3.2停留频率、平均停留时间和停留时间比率

3.3平均走时间和走时间比率

4讨论

4.1 E-选择素介导的流动增强型细胞粘附的“逆锁键”机制

4.2低剪应力情形，输运调控细胞的滚动?

4.3关于E-、L-和P-选择素介导的细胞粘附间的比较

5小结

第五章运用倒置流动腔技术研究E-选择素介导的流动增强型滚动

1引言

2结果

2.1细胞在正置和倒置方向上滚动的平均速率

2.2细胞在正置和倒置方向上滚动的瞬时速度差异

2.3细胞在正置和倒置方向上滚动的定量分析

2.4细胞从倒置流动腔壁面上解离

2.5滚动粘附细胞的解离率常熟

3讨论

3.1关于倒置流动腔实验的一点注记

3.2关于沉降效应与其可能的动力学机制

3.3水动力和重力耦合作用下滚动粘附细胞的解离

4小结

总结和展望

参考文献

附录

致谢

学习期间发表及拟发表的论文