益气健脾汤对裸鼠人肝细胞肝癌模型的抗癌作用研究

摘要

原发性肝癌(primary hepatic cancer，PHC)，简称肝癌，系原发于肝细胞和/或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，包括肝细胞癌、胆管细胞癌和混合性癌。具有发现晚、发展快、治疗难、预后差的特点。肝癌的发病率呈逐年上升趋势，是世界上发病率最高的10种肿瘤之一，占全世界每年新发现恶性肿瘤的4％，我国肝癌病例数约占全世界肝癌总例数的43.7％。就死亡率而言，肝癌在全球男性恶性肿瘤中居第7位，女性中居第9位。我国肝癌死亡率居恶性肿瘤死亡率的第2位，仅次于胃癌。由于肝癌的发病机制不甚明确，目前临床上还缺乏针对此病的特异性治疗。多采用外科手术、化疗、放疗、介入及中医药等综合治疗。 现代医学研究表明，肝癌的发生发展是一个多因素、多阶段的复杂过程，并伴随着多种基因的参与。PTEN是一个具有双重特异磷酸酶活性的抑癌基因，肝癌组织中PTEN可发生突变而丧失对肝癌细胞增殖的调控，PTEN的抑癌机制重要途径之一是通过对FAK的磷酸化实现的。FAK是与肝癌发生发展密切相关的常见信号通道之一。PTEN在细胞内正常表达时抑制FAK磷酸化，FAK被激活时能促进肿瘤细胞的增殖。 中医学文献中，虽然无肝癌的病名，但相似的症状和体征记载十分丰富，其多属于中医学“积聚”、“癥瘕”、“黄疸”、“臌胀”、“胁痛”等范畴。中医学认为，本病的发生是由于正气不足、脏腑功能失调、气滞、血瘀、痰凝、毒聚等多种因素经长时间交互形成的。本虚标实是肝癌的病机特点，其中，脾胃气虚为本，湿热、毒邪、气滞、血瘀为标。导师陈泽雄教授依据中医对肝癌“正虚邪实”、“本虚标实”这一发病机制的根本认识，认为邪正关系始终是肝癌发生和发展的关键，故“扶正祛邪”是治疗肝癌的根本大法。 益气健脾汤是导师对肝癌中医临床治疗经验的总结用方，具有益气健脾助运、疏肝解毒散结的功效。该方可明显改善肝癌患者的临床症状、提高肝癌患者的生活质量，但其作用机制目前不甚明了。因此，有必要在活体中进一步探讨本方的抗癌作用及机制。 研究目的： 1、观察益气健脾汤对间接原位移植雄性裸鼠肝癌模型的抗癌作用。 2、观察益气健脾汤对该模型解剖及生存情况的影响。 3、观察益气健脾汤对该模型肝组织、肝癌旁组织、肝癌组织PTEN及FAK表达的影响及其在三种组织中的表达强度。 材料： 1、造模材料：人肝细胞癌细胞株Bel—7402，接种人肝细胞癌细胞株Bel—7402的荷瘤裸鼠2只，BALB/c裸鼠，雄性，4-5周龄，80只。 2、干预材料：益气健脾汤浓缩剂；FT207注射液(替加氟注射液)。 3、试剂：兔抗人PTEN单克隆抗体、兔抗人FAK单克隆抗体、二步法免疫组化检测试剂。 实验方法： 1、造模采用Bel—7402人肝癌细胞株复制裸鼠“间接肝原位移植瘤模型”。 2、干预裸鼠在无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养。将造模裸鼠随机分为4组，裸鼠4组(生理盐水组、FT—207化疗组、中药A组、中药B组)，每组各20只，4组模型鼠术后即进入实验。胃饲给药，生理盐水组用0.9％生理盐水0.2ml/10g体重，余3组分别予以0.2ml药液/10g体重，每天一次，连续6周。 3、处理观察过程中，记录瘤鼠的生存时间。6周后各组随机处死一半，裸鼠处死解剖，记录瘤体积、并将正常肝组织、癌旁组织和癌组织标本用4％中性甲醛溶液固定，送病理石蜡包埋切片。进行解剖并病理切片，另一半停止药物干预，进行正常喂养，直到第10周后再处死余下瘤鼠。观察目标同前。 4、病理检测组织学检测，用常规苏木精一伊红染色(HE)；免疫组化检测，采用二步法免疫组化检测方法检测PTEN蛋白和FAK表达；染色结果评估，采用Bresalier半定量公式判断染色结果；读片采用双人双盲阅片，共2次，分别计算IS，取2次的平均数作为结果。 5、统计学分析：计量正态资料用“x±s”表示，非正态计量资料用“中位数(极值)”表示，计数资料用“部分/总体”，资料采用SPSS14.0统计软件计量资料进行T检验、方差分析、秩和检验、计数资料采用卡方检验、秩和检验。 结果： 1、解剖证实造模成功率78/79(生理盐水组有一只裸鼠因手术时麻醉过量死亡)；实验结束获得有效病理标本78例。成瘤以单发巨块型为主，部分伴肝内和/或肺内多发转移，符合人类肝癌解剖特点。 2、生存情况：中药A组生存时间长于化疗组、生理盐水组及中药B组，中药B组生存时间长于化疗组，p<0.05或p<0.01。 3、体重变化：中药A组在保持瘤鼠体重、减轻肿瘤对机体的消耗、控制恶液质的进展方面明显优于替加氟组和中药B组，p<0.05。 4、解剖情况：中药治疗与替加氟治疗比较不能明显减小瘤体积，p>0.05。 5、PTEN表达：中药治疗该肝癌动物模型与替加氟对比，可以明显提高抑癌基因PTEN的表达，p<0.05。中药治疗该肝癌动物模型与生理盐水对比，可以明显提高抑癌基因PTEN的表达，PTEN在中药治疗各组的三种组织中表达无差异，p<0.05。 6、FAK表达：FAK在中药B组第6周时的表达：正常肝组织>癌旁组织，癌组织>癌旁组织，在第10周时三种组织中无差异。FAK在中药A组三种组织中表达无差异。在正常肝组织中中药和生理盐水相比可以明显调控FAK的表达，P<0.05。 结论： 1、本研究所采用肝癌动物模型是研究肝癌治疗较为理想的实验动物模型。 2、益气健脾汤汤可以延长Bel—7402间接原位移植肝癌裸鼠模型的生存时间，提高生存率。显示以0.375g生药/kg体重浓度较佳。 3、益气健脾汤能够控制该模型裸鼠体重减轻，提高裸鼠生存质量，并减缓病情的进展。显示以0.375g生药/kg体重浓度较佳。 4、益气健脾汤均能够上调荷瘤鼠肝组织、癌旁组织PTEN蛋白的表达，显示以0.5g生药/kg体重浓度较佳。在正常肝组织中中药和生理盐水相比可以调控FAK的表达。

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