口腔变形链球菌ComCDE密度感应作用机制的实验研究

摘要

口腔链球菌的感染与菌斑生物膜的形成是龋病发生的根本病因。牙菌斑的形成过程中，浮游细菌定植于牙面后，密度感应就在菌斑的形成及致病过程中发挥重要的作用。密度感应指的是整群细菌中细菌与细菌之间的信号传递机制，细菌通过感应周围环境中同类细菌的群体密度的变动，发生感应现象从而调节相关基因表达。当群体细菌同时表达相同的基因，协调统一群体细菌的行为，使整群细菌同时表现出共同的生物学行为。这样，群体细菌就具备了单个离散细菌所无法具备的致病能力，细菌间的密度感应调控菌斑内菌群的基因转化、毒力因子表达、生长代谢、产酸耐酸，对整群细菌的生存与致病具有重要的意义。 变形链球菌ComCDE密度感应系统是多基因参与的调节系统，在生物膜形成及致病中的作用机制仍有许多问题有待研究：①细菌哪些基因受ComCDE密度感应调控；②其具体的调控过程是如何进行的；③所调控的目的基因的表达最终导致菌斑细菌产生什么样的生理行为和病理意义。 针对以上问题，本研究采用microarray基因芯片和实时定量荧光RT—PCR，检测变形链球菌UA159△comC突变株在外源性CSP信号肽作用下，密度感应相关基因以及下游相关基因的表达变化。应用LacZ基因报告系统分析变形链球菌ComCDE密度感应系统相关nlmAB、nlmC等基因在外源性CSP信号肽作用下，不同时间段启动子活性。通过细菌间竞争实验、细菌素产生抑菌实验、扫描电镜及激光共聚焦显微镜生物膜观察以及基因转化实验，分析ComCDE密度感应系统在变形链球菌生物膜形成，细菌素产生和基因转化等细菌毒力因子的调控作用。本课题旨在探索口腔变形链球菌ComCDE密度感应系统具体的基因调控过程以及对下游毒力因子的调控作用，从细菌表型、基因转录调控等层面上认识ComCDE密度感应的调控作用。 第一章变形链球菌ComCDE密度感应调控变链菌细菌毒力表型的实验研究 目的：探讨变形链球菌ComCDE密度感应系统对变链菌相关的变链素产生、菌种间竞争，生物膜形成以及基因转化等毒力表型的影响调控。 方法：通过细菌间竞争实验，观察变形链球菌UA159，△comC，△comD，△comE突变株和血链球菌S.sanguinis之间的生存竞争关系；通过变链素产生抑菌实验，检测变形链球菌野生株GS5、△comC，△bip，△smbG，△smbA突变株变链素产生抑菌能力；通过CSP信号肽诱导，将pDL278质粒转化入△comC，△comD，△comE突变株中，检测各菌株基因转化率；通过激光共聚焦显微镜和扫描电镜，观察S.mutans△comC突变株在外源性CSP信号肽作用下，生物膜形成能力及生物膜内部细菌活性。 结果：①不同菌种间细菌竞争实验，变形链球菌△comC，△comD，△comE突变株失去不同菌种间的竞争力，无法抑制相邻的S．sanguinis的正常生长；只有变形链球菌UA159野生株具有竞争力，抑制相邻S.sanguinis的正常生长，形成月牙形的缺陷菌环。②变链素抑菌实验中，变形链球菌野生株wt形成明显的大直径的圆形抑菌圈，△smbA形成直径较小的抑菌圈，△comC，△bip和△smbG突变株没有形成抑菌圈。③生物膜结构观察及细菌活性分析显示，加入CSP信号肽后，形成的12h生物膜死菌数量增高64.5％(p=0.00)，24h后死菌量增高76.3％(p<0.05)；活菌数量亦显著增高，24h生物膜活菌数量增高89.3％(p=0.00)。④在CSP诱导下，△comC突变株基因转化率升高100多倍，但△comD，△comE突变株基因转化率没有明显变化。 结论：变形链球菌ComCDE密度感应系统影响变链菌的变链素产生、菌种间竞争、生物膜形成以及基因转化。 第二章变链菌ComCDE密度感应调控基因表达cDNA基因芯片研究 目的：采用变形链球菌UA159全基因组表达谱cDNA基因芯片技术，检测变形链球菌UA159 AcomC突变株在加入外源CSP信号肽5min，15min，30min，60min后的全基因组基因表达，分析细胞整个基因组基因表达变化全貌。 方法：变形链球菌UA159△comC突变株在加入外源CSP信号肽5min，15min，30min，60min后，冷Trizol法提取总RNA，采用RNeasy MinElute Cleanup column试剂盒纯化总RNA，采用SuperScript Plus Indirect cDNA Labelling System试剂盒合成一链cDNA，通过MinElute PCR Purification试剂盒纯化一链cDNA，采用alexa555和alexa647进行cDNA间接荧光标记，纯化后的cDNA与美国基因组研究所(The Institute for Genomic Research，TIGR)提供的S.mutans UA159全基因组cDNA芯片进行杂交，芯片由Perkin ScanArray5000XL Reader芯片扫描仪扫描，荧光强度以及数据分析通过TM4生物芯片数据分析软件Spotfinder v3.1.1，MIDAS v2.19，和MeV4.3.01进行数据分析。 结果：S.mutans UA159基因芯片表达谱的筛选中，加入CSP信号肽后，所有时间点中，总共51个基因表达水平显著上调，基因功能分类包括：①变链素编码和免疫相关基因15个，其中变链素产生、分泌和免疫蛋白编码基因8个(Bacteriocin)；②信号传导基因4个(Signal transduction)；③结合运输相关基因14个，其中编码基因11个(Transport and binding proteins)；④压力反应相关基因4个(Stress response)；⑤能量代谢相关基因3个(Energy metabolism)：⑥其他功能的基因9个(others)。 结论：变形链球菌UA159密度感应ComCDE系统主要调节变链素编码、分泌免疫相关编码基因。同时影响信号传导基因，结合运输相关基因，压力反应相关基因，能量代谢等相关基因的表达。 第三章变形链球菌ComCDE密度感应调控基因表达的realtimeRT—PCR研究 目的：采用realtime RT—PCR对芯片筛选出来的毒力因子相关的功能基因表达进行进一步的验证。 方法：变形链球菌UA159 AcomC突变株在加入外源CSP信号肽15min后，Hot—Phenol法提取总RNA，采用QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒逆转录RNA，采用QuantiTect() SYBR()Green PCR kit试剂盒，实时定量检测细菌素产生相关基因nlmA，nlmC；基因转化相关基因cinA，comA，coiA，comX，和comYA；生物膜形成相关基因smaA，lytA；压力反应相关基因hrcA，dnaK等基因的表达。 结果：realtime RT—PCR和microarray检测基因变化趋势一致，两组数据CORREL相关系数达0.964，细菌素产生相关基因nlmA，nlmC升高倍率分别为61.26和12.21倍；压力反应相关基因hrcA，dnaK升高倍率分别为5.045和3.008倍；基因转化相关基因comX升高2.523倍；生物膜形成相关基因smaA升高1.708倍。 结论：经过realtime RT—PCR证实，基因芯片结果可信度高，变链菌ComCDE系统主要调节变链素编码、分泌免疫相关编码基因，同时影响信号传导基因，压力反应相关基因等毒力相关基因的表达。 第四章应用LacZ报告系统研究口腔变形链球菌ComCDE密度感应调控相关基因的启动子活性 目的：研究ComCDE密度感应调控下S.mutans变链素相关基因启动子表达的特异性及持续性，探讨ComCDE系统调节变链素合成免疫，对变形链球菌的生理代谢和毒力因子表达的影响作用。 方法：用含β—半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和nlmAB、nlmC基因启动子组成的重组体的SM△comC和SM△comDE突变株，在加入外源CSP信号肽后，连续510min检测nlmAB、nlmC基因启动子的β—半乳糖苷酶(lacZ)酶活性。同时，对ComCDE密度感应调控下S．mutans变链素相关蛋白表达是所需能量进行分析。 结果：在comDE突变株中，加入CSP信号肽后，nlmAB和nlmC的启动子活性无显著性变化，在comC突变株中，加入CSP信号肽后，nlmAB和nlmC的启动子活性分别升高4.66倍和5.19倍(p<0.01)；在加入CSP肽后，nlmAB基因启动子活性逐渐增高，且在210min达到高峰后，一直持续性表达；nlmC启动子活性逐渐增高8.42倍(p<0.01)，在60min达到高峰后，一直持续510min保持高表达，且变链素nlmAB和nlmC的持续性高表达需要消耗大量ATP。 结论：变链素相关基因nlmAB和nlmC的表达是ComDE蛋白依赖性，受ComCDE双组分信号系统特异性调控，在密度感应ComCDE系统调节下，变链素相关基因nlmAB和nlmC保持持续性高表达，并消耗大量能量，影响其生理毒力作用。

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论文说明：缩略词表

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引言

第一章变形链球菌ComCDE密度感应调控变链菌细菌毒力表型的实验研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

参考文献

第二章变形链球菌ComCDE密度感应调控基因表达的cDNA基因芯片研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

参考文献

第三章 口腔变形链球菌ComCDE密度感应调控基因表达的realtime RT-PCR研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

参考文献

第四章应用LacZ报告系统研究口腔变形链球菌ComCDE密度感应调控相关基因的启动子活性

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

5.小结

参考文献

全文总结

附录

发表论文一

发表论文二

致谢