HLA-G基因RNA干扰和过表达在肝癌细胞中对NK细胞免疫监视功能的影响

摘要

研究背景:
　　 肝脏移植是治疗终末性肝病和肝癌有效治疗手段，疗效得到医学界肯定，但术后肿瘤复发和远处转移是阻碍肝癌肝移植获得长期疗效。如能采取有效手段增强机体对残余癌细胞的免疫监视功能，就可以减少其复发和远处转移，达到长期根治目的。
　　 在肿瘤免疫中，NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞是机体抵抗肿瘤生长和病毒感染的重要免疫效应细胞，在细胞免疫起主要作用。T淋巴细胞是肿瘤特异性、并受HLA-I分子限制，其免疫启动是癌细胞HLA-I分子向T淋巴细胞TCR递呈免疫原性多肽。癌细胞表面经典HLA-I分子的丢失是肿瘤生物学中一个普遍现象，这正是肿瘤针对T淋巴细胞采取的一种主要逃逸机制。NK细胞与CTL不同，其识别杀伤抑制受体和杀伤活化受体。肿瘤细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达降低时，NK细胞识别的抑制信号消失，KAR占优势，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。因此，HLA-Ⅰ类抗原缺失或变异的肿瘤细胞能够逃脱T细胞的免疫监视，但又变为对N K细胞敏感，为N K细胞所杀伤。NK和CTL识别HLA-Ⅰ类分子产生的不同结果，使二者功能互相补充，共同完成机体的免疫监视仟务。
　　 人白细胞抗原-G是非经典的HLA-Ib分子，选择性表达于母胎界面的滋养层细胞。HLA-G不同于其它HLA-I分子在于：①有限多态性；②表达具有组织特异性；③有七种蛋白亚型；④导致免疫耐受。HLA-G通过直接与ILT-2,ILT-4，and KIR2DL4受体结合，从而抑制NK细胞、T细胞及抗原递呈细胞功能。可溶性HLA-G还可以与CD80受体结合，从而导致NK细胞、T细胞调亡。HLA-G自从1998年首次在肿瘤中检测到HLA-G转录产物以来，大量的研究证实在多种肿瘤组织中检测到HLA-G转录产物及蛋白。由于HLA-G免疫耐受的特性，其在肿瘤中表达被认为是肿瘤免疫逃逸的重要机制。
　　 目的:
　　 1、在mRNA和蛋白水平上，分析HLA-G在肝癌细胞系、肝细胞系的表达情况。
　　 2、通过RNAi技术，构建HLA-G shRNA载体，在Bel-7402细胞建立稳定干扰细胞株，在mRNA及蛋白水平下调的HLA-G基因表达。
　　 3、通过基因克隆技术，构建HLA-G基因表达载体，在Hep3B细胞建立稳定表达细胞株，在mRNA及蛋白水平上调的HLA-G基因表达。
　　 4、通过上述两种技术，探讨HLA-G基因在NK介导的肝癌免疫监视中的作用。
　　 方法:
　　 1、通过免疫荧光细胞化学、Real-Time PCR及Western Blot技术检测肝癌细胞系、肝细胞系中HLA-G mRNA水平和蛋白水平的表达情况。
　　 2、构建pGPU6/GrP/Neo/HLA-G shRNA载体并应用双酶切及测序验证载体，稳定转染至肝癌Bel-7402细胞，建立稳定干扰细胞株，通过Real-Time PCR及Western Blot检测mRNA及蛋白水平变化。
　　 3、构建pEGFP-C1-HLA-G载体并应用PCR、双酶切及测序验证载体，稳定转染Hep3B细胞，建立稳定表达HLA-G基因细胞株，通过Real-Time PCR及WesternBlot检测mRNA及蛋白水平变化。
　　 4、LDH法检测HLA-G基因表达对NK92-MI细胞杀伤的影响以及其与NK92-MI表面ILT2、KIR2DL4受体相互作用关系。
　　 结果:
　　 1、免疫荧光细胞化学显示肝癌细胞系、肝细胞系均有HLA-G基因表达，HLA-G蛋白表达位于细胞浆及细胞膜。Real Time PCR显示，肝癌细胞系、肝细胞系均检测到HLA-G mRNA表达(P<0.05)，肝癌细胞系HLA-G mRNA水平高于肝细胞系L02(P<0.05)。Western Blot显示，肝癌细胞系、肝细胞系均检测到HLA-G蛋白表达(P<0.05)，除MHCC97-H、Hep3BHLA-G蛋白表达量与L02相比无统计学差异(P>0.05)外，其它肝癌细胞系HLA-G蛋白表达量高于L02。
　　 2、经双酶切及测序验证，成功构建pGPU6/GFP/Neo/HLA-G shRNA载体，应用电穿孔技术将重组载体转染至肝痛Bel-7402细胞，流式细胞仪检测转染效率为64.69％，建立稳定干扰HLA-G基因的细胞株。经Real Time PCR检测显示，GFP、NC、HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4组mRNA水平的抑制率分别为0.66％、3.47％、50.40％、43.31％、88.73％、1.72％；Western Blot结果显示，GFP、NC、HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4组蛋白水平的抑制率分别为0.12％、0.43％、3.69％、20.07％、58.72％、62.36％、25.59％0
　　 3、经PCR、双酶切及测序验证，成功构建pEGFP-C1-HLA-G载体，应用lipofectamine2000将重组载体转染至肝癌Hep3B细胞，流式细胞仪检测转染效率为63.28％，建立稳定表达HLA-G基因的肝癌细胞株。经Real Time PCR检测显示，在mRNA水平上，Hep3B-HLA-G组较Hep3B组增长了约180倍。WesternBlot结果显示，在蛋白水平上，Hep3B-HLA-G组较Hep3B组增长了约10倍。
　　 4、未封闭组中，NK92-MI细胞在E/T为2.5、5、10、20时，对Bel-7402-HLA-G3-NB组杀伤率分别上升约11.75％±1.88％、11.63％±0.68％、14.14％±0.28％、15.37％±0.97％(P<0.05)，而对Hep3B-G-NB组杀伤率分别下降为18.91％±2.32％、20.55％±0.94％、22.68％±2.08％、19.83％±1.62％，差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　 5、封闭ILT2、KIR2DL4、ILT2+KIR2DL4受体组和未封闭组比较，NK细胞的杀瘤活性均具有统计学差异(P<0.05)。
　　 结论:
　　 1、HLA-G基因在肝癌细胞系HepG2、Huh7、SMMC-7721、Bel-7402、PLC、MHCC97-H、Hep3B与肝细胞系L02存在不同程度的表达。HLA-G蛋白表达定位于细胞浆和细胞膜。HLA-G在mRNA水平肝癌细胞系均比L02表达高，在蛋白水平，肝癌细胞系除MHCC97、Hep3B外，均较L02高；
　　 2、成功构建pGPU6/GFP/Neo/HLA-G shRNA载体，在mRNA水平和蛋白水平有效抑制效率分别为88.73％和62.36％；
　　 3、成功构建pEGFP-C1-HLA-G重组载体，重组载体在mRNA水平和蛋白水平分别上调180倍和10倍；
　　 4、当靶细胞内HLA-G下调，NK92-MI细胞能增强对靶细胞的杀伤增强；当靶细胞内HLA-G上调时，NK细胞对靶细胞的杀伤能力减弱：
　　 5、封闭KIR2DL4、ILT2受体后，NK92MI细胞对靶细胞的杀伤能力普遍下降。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照

声明

前 言

第一部分 HLA-G基因在肝癌细胞系中的表达及其意义

1.1 材料和方法

1.2 结果

1.3 讨论

第二部分 HLA-G-shRNA载体的构建、鉴定及对肝癌Bel-7402细胞抑制作用的研究

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三部分 HLA-G过表达载体的构建及其对Hep3B细胞功能的影响

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四部分 肝癌细胞HLA-G表达对NK92-M1杀伤作用影响及其与NK92-MI表面ILT2、KIR2DL4受体与相互作用的研究

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

全文结论

创新之处

论文主要不足之处

参考文献

附录

致 谢