棉铃虫(Helicoverpa armigera)14-3-3ζ基因的克隆和表达

摘要

棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种蛹滞育昆虫，5龄和6龄幼虫期是其滞育诱导的关键时期。14-3-3蛋白是一类高度保守的酸性蛋白，扮演一个各种生物过程的调节者的角色，例如：信号传导，细胞周期调控，细胞凋亡，生长发育，转录调节。利用了差减杂交的方法得到了棉铃虫滞育与非滞育6龄幼虫之间的差异基因14-3-3ζ。14-3-3ζ在神经组织有较高的表达，在非神经组织有一定量的表达。14-3-3ζ在细胞核和细胞质中都有表达，说明其可以在核与胞质之间穿梭。滞育型6龄幼虫脑中14-3-3ζ的表达量一直高于非滞育型，且随着发育表达量不断升高，一直到化蛹前都维持在高水平，暗示其在滞育过程中可能发挥着某种作用。dsRNA干扰14-3-3ζ的表达导致细胞加快增殖暗示14-3-3ζ的作用是通过抑制细胞周期关键蛋白活性的方式保证细胞正常分裂。14-3-3ζ能应答热激反应表达增高，说明其可能是一种应答外界压力的蛋白。 本文初步研究显示出14-3-3ζ与滞育具有一定的相关性，为今后更深入的研究14-3-3ζ在滞育过程中的作用奠定了基础。

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声明

1.前言

1.1 昆虫滞育概述

1.2概述14-3-3家族蛋白研究

1.3抑制性差减杂交(Suppression Subtraction Hybridization)

1.4本实验研究目的及意义

1.5实验设计

2.材料和方法

2.1 昆虫饲养和材料收集

2.2滞育诱导敏感点的摸索

2.3 总RNA抽提

2.4 mRNA纯化

2.5反转录反应

2.6差减杂交(SSH)

2.7 RACE反应

2.8蛋白原核表达表达

2.9抗体制备

2.10 western blot

2.11半定量RT-PCR

2.12昆虫细胞的培养和质粒的转染

2.13细胞核定位

2.14细胞水平RNA干扰

2.15细胞热激实验

3.结果分析和讨论

3.1 抑制性差减杂交(SSH)

3.2棉铃虫14-3-3ζ基因克隆

3.3棉铃虫14-3-3ζ的原核表达和抗体制备

3.4棉铃虫14-3-3ζ的表达定位

3.5棉铃虫6龄幼虫Br 14-3-3ζ表达模式

3.6干扰14-3-3ζ基因表达影响细胞生长

3.7热激导致14-3-3ζ表达发生变化

3.8 总结

参考文献

附录

致谢