中国禽流感病毒(H5N1)HA、NA基因的分子进化及克隆、表达研究

摘要

流感病毒是一种造成人类和动物患流行性感冒的RNA病毒，属于正粘病毒科。禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的禽类的一种急性、高度致死性、烈性传染病。该病被国际兽疫局(OIE)定为A类传染病并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。由H5和H7两个血清型AIV所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)，其发病率和病死率都很高，危害极大，常造成严重的经济损失。进入20世纪以来，禽流感发生频率加快、次数增多、范围扩大，并且突破中间屏障，直接感染人类并致死，给世界各地禽类养殖和人类健康造成越来越严重的危害。禽流感不断流行，主要是其HA和NA的抗原性不断发生变异，其内部蛋白也可发生变异。抗原变异幅度的大小直接影响流感流行的规模。但是人们对于禽流感病毒的进化过程和抗原的变异特性还不是十分清楚，不利于禽流感疫情的监测和疫苗的开发。而随着高致病性禽流感病毒的不断适应性突变，人禽流感的爆发只是时间问题。现有的疫苗不能满足应对人禽流感大爆发的需要。因此加强禽流感病毒基因变异情况、抗原变异规律的研究并开发新型疫苗十分必要。禽流感病毒的最主要的免疫原性相关蛋白为HA和NA蛋白。HA可诱导机体产生中和抗体，NA诱导机体产生特异性的抗体。因此，本研究以H5N1病毒的HA和NA为研究对象，对中国不同地区和年代的H5N1病毒的主要抗原HA和NA的进化和变异情况进行了研究，并选择合适的表达系统(毕赤酵母表达系统)对HA和NA蛋白进行了克隆和表达，为在毕赤酵母系统中生产新型病毒样颗粒疫苗打下基础。 [目的]: 1.分析我国不同地区、不同年代H5N1禽流感病毒HA和NA的变异特点和趋势，分析其抗原变异特征，为H5N1禽流感流行的防治提供科学依据。 2.克隆禽流感病毒H5A和N1A基因，重组到毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中分泌表达，为在毕赤酵母系统中生产新型病毒样颗粒疫苗打下基础。 [方法]: 1.在Genbank和美国洛斯阿拉莫斯国家实验室流感数据库搜索筛选来自中国不同地区和年代的H5N1病毒HA、NA基因序列。用Clustal—W、Bio—edit、MEGA．4.1软件等生物信息学软件包对HA、NA基因核苷酸和氨基酸的变异和分子进化进行分析。 2.分析中国不同地区H5N1病毒的HA和NA基因的抗原变异特征。 3.PCR扩增了禽流感病毒H5A和N1A基因，克隆入含有AOX1启动子和分泌信号肽序列的pichiapastoris酵母表达载体pPIC9K中从而构建重组载体。 4.经电穿孔转化酵母宿主菌GS115筛选高拷贝重组转化子筛选后摇瓶培养，1％甲醇诱导表达。诱导培养上清经SDS—PAGE和Western—blot检测蛋白表达情况。 [结果]: 1.对86株H5N1禽流感病毒株的HA基因进行多序列比对，共有1129个保守位点，578个可变位点。在1031-1033位点，共有25条序列有碱基缺失，在1021-1023位点，共有4条序列有碱基缺失。对96株H5N1禽流感病毒株的NA基因进行多序列比对，共有908个保守位点，502个可变位点。在104-204位点，有74条序列有碱基缺失。在149-204位点，A/Hongkong/482/97、A/Hongkong/485/97、A/Hongkong/156/97有碱基缺失。 2.成功构建了HA、NA系统进化树，结果显示国内H5N1禽流感毒株大体分为两大支，不同地区和时间的的遗传演化分布较为复杂。关系比较复杂，在时间和地域上来看不是简单推移关系。 3.1996年以来HA蛋白形成比较稳定的变异的氨基酸位点为61位(N→D)、100位(S→N)、228位(E→K)、233(P→S)、499位(K→R)、528位(M→I)。1996年以来NA蛋白形成比较稳定的变异的氨基酸位点为17位(V→I)、20位(I→V)、270位(N→D)、460位(D→G)。 4.对HA基因的抗原特征进行分析发现，06年以来的HA裂解位点序列多为5个连续的碱性氨基酸，并且在裂解位点附近的氨基酸序列均有T→S，Q→L位点的突变。人禽流感病毒株均为5个碱性氨基酸，并且在裂解位点附近的氨基酸序列均有T→S，Q→L的突变。HA序列具有6-9个糖基化位点，其中181、302、500和599位具有相同的糖基化位点。人禽流感序列均含有7个糖基化位点，分别为27、39、181、209、302、500和599。近年分离自香港禽类的一些病毒株HA基因在靠近HA受体结合位点附近的156位出现了糖基化位点。近年来中国大陆的人禽流感病毒株HA的190位受体结合位点为I，228位受体结合位点为K。而禽类的HA的190位受体位点为Y。抗原位点分析表明人源HA序列的抗原位点的变异情况主要是A抗原位点的140位N→D，142位D→E；B抗原位点156位R→T，157位S→P，190位V→I，197位P→S。 5.中国H5N1病毒株NA基因在04年以来均存在20个氨基酸的茎部缺失，丧失了50、58、63和68位置上的糖基化位点。人来源的禽流感病毒NA序列除了A/HongKong/213/2003含有7个糖基化位点外，其余序列均只有3个糖基化位点。 6.电泳和测序证实已成功将H5A和N1A基因成功克隆入表达载体pPIC9K中。诱导培养上清经SDS—PAGE和Western—blot检测有目的条带。 [结论]: 1.HA和NA基因变异范围大，氨基酸极易变异。在1031-1033位点，共有25条序列有缺失，缺失的主要是2004-2007年的人流感和禽流感病毒株。NA基因在104-204位点，有74条序列有60个核苷酸的缺失。无缺失的主要为1999年至2003年华南地区的人流感与禽流感病毒株。提示04年后我国的H5N1禽流感病毒流行株随时间和传播地域的扩大，不断发生适应性的突变。 2.从HA基因的分子进化树可以看出，中国来自不同地域的H5N1毒株有不同的起源，主要分为两大分支，一支为广东96禽流感分支，一支为03香港分支。从NA基因的分子进化树可以看出，我国不同地区和年份的H5N1病毒株分为两大支。一支为A/Hongkong/482/97、A/Hongkong/485/97、A/Hongkong/156/97分支，其余为另一分支。1997和2003年的香港人禽流感的爆发和大陆地区禽流感的流行没有直接关系。03年以后的人感染禽流感有可能是禽流感病毒重组后获得了感染人的能力。 3.来源于人的H5N1禽流感病毒株与来源于禽的病毒株的HA基因抗原位点、碱基裂解位点、糖基化位点和受体结合位点有一定的差异，尚需进一步研究这是否会引起其毒力的增强以及对宿主的选择性的变化。中国H5N1病毒株NA基因在04年以来均存在20个氨基酸的茎部缺失，丧失了50、58、63和68位置上的糖基化位点。可能是病毒在自然选择的压力下发生的变异，有利于病毒的存活。 4.采用PCR技术从重组质粒中扩增出H5A和N1A基因，并构建酵母表达载体pPIC9K—H5A、pPIC9K—N1A，电转化毕赤酵母GS115。采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株后，用甲醇诱导表达。SDS—PAGE技术分析其重组蛋白的表达情况，确定第三第四天表达量最高。Western—blot检测目的蛋白能与H5亚型的AIV血清结合。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.禽流感病毒研究进展

2.毕赤酵母表达系统

3.本研究的目的意义

第二章 中国H5N1禽流感病毒HA、NA基因的分子进化研究

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

第三章禽流感病毒HA、NA基因在毕赤酵母中的分泌表达

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

第四章结论

1.主要结论

2.有待进一步开展的工作

参考文献

附录 氨基酸缩写列表

致 谢