CYP450酶活性评价的体外“cocktail”模型的优化与应用

摘要

细胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)是体内最大的药物代谢酶蛋白超家族之一，由许多的同工酶组成。涉及药物代谢的CYP450酶系主要是CYP1、CYP2、CYP3三个家族的几种酶：如：CYP1A2、CYP2A6、CYP286、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4等，并且它们参与了90％以上的临床药物的代谢，对许多内源、外源性化合物在体内的Ⅰ相生物转化起到重要作用。研究药物的相互作用的方法有体外方法(in vitro)、体内方法(in vivo)，计算机模拟方法(in silico)。在新药研发早期的筛选研究中，利用人肝微粒体孵育技术评价药物对探针代谢情况是体外研究药物相互作用较为成熟的一个方法。经典的方法即是，通过孵育特异性的探针药物，经过特定的亚型酶代谢，检测代谢物的生成量从而反应酶活性的信息。近年来，随着高灵敏高选择的液质联用(LC/MS/MS)技术的广泛应用，以及组合化学的发展，同时给予多种探针药物，即“cocktail”法，来获取多个代谢酶活性评价信息的方法也得到了迅速发展。 近年来，中药的应用越来越广泛，临床上中药与其它药物合并用药发生相互作用的几率也增大。在这些由相互作用引起的不良反应中，中药对细胞色素P450酶的影响占了很大的比例。大量研究已经应用各种方法证明多种中药的活性成分是CYPs的底物、抑制剂或诱导剂。面对成千上万种中药单体，我们必须建立一种便捷、可靠的高通量筛选的方法，也就是上述的“cocklail”方法，来研究它们对CYPs的影响从而预测可能存在的药物相互作用。 本课题组已经成功建立了含有6种CYP(包含CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4)亚型的“cocktail”方法，并对多种黄酮类、帖类中药单体进行了考察。近期研究表明，CYP286的表达占到了整个CYP450酶表达的6％，而且在许多非肝组织中也发现了CYP286的表达，比如脑部，肺部。CYP2A6主要在肝脏中表达，约占总肝细胞色素P450的5％。CYP2A6除了参与一些临床药物，例如甲氧氟烷、氯甲噻唑、香豆素等的代谢外，还是某些致癌物(黄曲霉素B)及环境化合物(汽油醚)的代谢酶。CYP2C19也占了整个肝表达的2％。 本课题组已经成功建立了含有6种CYP亚型的“cocktail”方法，因此，本研究的目的就是在此基础上进一步建立包含对CYP2A6、CYP286、CYP2C19评价的“cocktail”方法，并对姜黄素类似物及香豆素类中药单体进行筛选，以考察其对此3种亚型的抑制程度。研究共分为以下四个部分。 第一部分人肝微粒体中3种探针代谢物的LC/MS/MS分析方法的建立 目的： 建立检测人肝微粒体中7-羟基香豆素、羟基丁氨苯丙酮、5-羟基奥美拉唑以及内标氯雷他定的LC/MS/MS方法。 方法： 人肝微粒体样品以乙酸乙酯(0.5 mL)为萃取剂，以氯雷他定为内标。质谱条件为：离子源ESI+，选择反应监测模式(SRM)，监测离子：m/z163→107(7-羟基香豆素)，m/z256→167(羟基丁胺苯丙酮)，m/z362→214(5-羟基奥美拉唑)。m/z383→262(内标)。液相条件：分离柱C18 XTerra MS分析柱(5μm，150×2.1 mm．Waters，USA)；流动相为甲醇：水(含0.1％甲酸)(80：20，v/v)，流速为250μL/min，柱温为室温。分析时间为3.5 min。 结果： 7.羟基香豆素/羟基丁氨苯丙酮/5-羟基奥美拉唑的线性范围分别为0.032/0.32/0.078/—2/20/5μM。三个质控浓度为：0.064/0.64/0.156μM，0.25/2.5/0.625μM和1/10/2.5μM。三者的萃取回收率分别为93.4-97.0％/75.6-87.9％/87.3-95.1％。三者的批内及批间精密度、准确度、稳定性的RSD及偏离度均小于15％。三者的基质效应分别为101.6-112.8％/86.5-96.4％/97.3-103.9％，而且是非浓度依赖型的，基质效应很小，不会影响检测，符合生物样本检测的要求。 结论： 建立了检测人肝微粒体中7-羟基香豆素、羟基丁氨苯丙酮、5-羟基奥美拉唑以及内标的浓度LC/MS/MS方法，方法精密度、准确度好，灵敏度高，适用于后续研究。 第二部分人肝微粒体体外“cocktail模型的建立与验证 目的： 优化人肝微粒体的体外孵育体系；比较探针在“individual”和“cocktail”模型中的各种代谢行为，以验证“cockiail”模型的准确可行。 方法： 1、优化人肝微粒体的体外孵育体系。 2、求算各种特异性抑制剂在两个模型中的IC50值，并进行比较来验证“cocktail”模型的准确可行。 μ结果： 1、优化后的人肝微粒体体外孵育体系为：总体积为0.2 mL，蛋白浓度为0.25mg/mL，反应时间为20 min。 2、香豆素、丁胺苯丙酮、奥美拉唑的特异性抑制剂甲氧沙林(CYP2A6)，噻氯匹啶(CYP286)，氟康唑(CYP2C19)在“individual”和“cocktail”模型中IC50值分别为：6.39，11.30；0.2557，0.2122；6.52，15.22μM。两者数值相近。 结论： 建立了优化的人肝微粒体的体外孵育体系；特异性抑制剂在“individual”和“cocktail”模型中IC50值也相似，且与文献报道相似。证明“cocktail”模型准确可行，为后续的中药单体筛选奠定了基础。 第三部分应用体外“cocktail”模型评价姜黄素类似物对CYP酶的影响 目的： 应用此“cocktail”模型对6种姜黄素类似物进行筛选，评价它们对3种CYPs亚型的抑制程度。 方法： 不同浓度的姜黄素类似物和底物混合液共同孵育，与空白对照(只含等量的溶剂)相比较，通过“二步法”来评价其对CYPs各个亚型的抑制作用。第一步：首先将每个姜黄素类似物设定3个浓度(1，10，50μM)，进行初步地筛选，判断其对CYP酶的抑制程度。第二步：根据第一步的结果，对于那些抑制作用较强的姜黄素类似物，设定合理的浓度范围(5或6个浓度点)，用Graphpad Prism来计算，进一步求算出确切的IC50值。 结果： 6种姜黄素类似物对CYP2A6、CYP2C19的IC50均大于50μM，无抑制影响；姜黄素类似物B及F对CYP286的IC50为分别为13.95μM及13.35μM，均是弱抑制剂。 结论： 应用体外cocktail法成功地对6种姜黄素类似物进行了筛选。并筛选出两种体外有一定抑制能力的化合物，提示有可能会引起药物的相互作用。 第四部分应用体外“cocktail”模型对香豆素类中药单体进行抑制筛选 目的： 应用体外“cocktail”模型对12种香豆素类中药单体进行筛选，明确它们对CYPs各个亚型的抑制作用。 方法： 通过“二步法”及Graphpad Prism来评价香豆素类中药单体对CYPs各个亚型的抑制作用并计算相应的IC50值。 结果： 结果表明6-羟基—7-甲氧基香豆素、毛两面针素是CYP286的中等程度抑制剂，IC50分别是31.5μM、3.542μM；异嗪皮啶、双香豆素、4-甲基—6，7-二羟基香豆素、6-甲基香豆素、4-乙氧基香豆素对2C19抑制的IC50值分别是2.613μM．6.673μM、1.333μM、27.68μM．3.09μM。 结论： 香豆素类中药单体对3种CYPs亚型普遍存在着不同程度的抑制，提示有可能会引起药物的相互作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分人肝微粒体中6种探针的目标代谢物的LC/MS/MS分析方法的建立

1实验材料与仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

附图及表格

第二部分人肝微粒体体外“cocktail”模型的建立与验证

1实验材料与仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

附图及表格

第三部分应用体外“cocktail”模型评价姜黄素类似物对CYP酶的影响

1实验材料与仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

附图及表格

第四部分应用体外“cocktail”模型对香豆素类中药单体进行抑制筛选

1实验材料与仪器

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

附图及表格

总结与创新

展 望

参考文献

致 谢