中华蜜蜂中肠细胞培养及CSBV感染中华蜜蜂和意大利蜜蜂幼虫的蛋白质组分析

摘要

蜜蜂是重要的传粉昆虫和蜂产品生产者，也是研究衰老、社会行为和神经生物学领域的重要模式生物。为了研究蜜蜂的疾病控制，本论文对中华蜜蜂(中蜂)中肠上皮细胞进行了原代培养；鉴定中蜂囊状幼虫病的病原，测定了中蜂幼虫对3种病原的取食作用，并以中蜂幼虫繁殖中蜂囊状幼虫病病毒；分析研究了中蜂囊状幼虫病病毒感染中、意蜂(意大利蜜蜂)营养杂交幼虫的蛋白组变化。 本研究从中蜂6日龄幼虫中分离中肠上皮细胞，置于含有20％胎牛血清的Grace培养液的48孔细胞培养板中，连续培养了20周。在培养过程中观测到了干细胞、柱状细胞和杯状细胞三种类型的中肠细胞，并且干细胞分化形成了柱状细胞和杯状细胞。尽管细胞也有繁殖，但是细胞数量在3周后仅为仞始细胞数量的28％(9.0-2.5x104/ml)。在4到20周的培养期间，细胞数量在0.8-1.2x104/ml之间。在细胞培养物中添加细胞生长因子肝素(heparin)和20HE未能增加细胞数量和提高分化比率。培养过程中发现了类围食膜状的分泌物质。这是首次对蜜蜂中肠上皮细胞成功进行的原代培养。 中蜂囊状幼虫病是蜜蜂最为常见的一种病害。本文采用电镜观测、RT—PCR和核酸序列测序比对三种方法，鉴定了中蜂囊状幼虫病(CSBV)病原。以带荧光基因的大肠杆菌、昆虫病原线虫共生菌Photorhabdus luminescens H06和CSBV病毒原液饲喂中蜂2日龄幼虫，发现蜜蜂幼虫可取食这些病原。这可能是蜜蜂在幼虫期易感染病害的原因之一。为了繁殖中蜂囊状幼虫病病毒，在实验室条件下以CSBV饲喂2日龄中蜂幼虫，饲喂2，4，6，8h的幼虫在培养24 h后死亡率分别为8.3％、16.7％、58.3％和58.3％，72h后死亡率分别为75.0％、66.7％、100％和91.7％。 本研究还分析了营养杂交(中蜂王浆饲喂意蜂幼虫或意蜂王浆饲喂中蜂幼虫)的中、意蜂3日龄幼虫蛋白表达图谱。结果表明，营养杂交可改变蜜蜂幼虫的蛋白表达。比较营养杂交的中蜂3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点为4个(营养杂交后3个消失，1个出现)，上调蛋白点(3倍以上)为5个，下调蛋白点(3倍以上)为11个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，消失的蛋白分别为肌动蛋白、泛素缀合酶2(E2)和变态化学趋向蛋白(che—3)，出现的蛋白为转录剪接因子(SF2)。比较营养杂交的意蜂3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点为11个(营养杂交后6个消失，5个出现)，上调蛋白点(3倍以上)为8个，下调蛋白点(3倍以上)为10个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，消失的蛋白分别为Hsp5、分子伴侣TCP-1、硫氧还蛋白过氧化物酶1、转录延伸因子2(EF—2)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)和1个未知功能蛋白，出现的蛋白分别为线粒体节果酸脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和3个未知功能蛋白。 本研究还测定了CSBV感染的中、意蜂营养杂交3日龄幼虫的蛋白图谱的变化。比较中蜂3日龄幼虫(中蜂王浆培养)和CSBV感染的3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点为7个(CSBV感染后1个消失，6个出现)，上调蛋白点(3倍以上)为16个，下调蛋白点(3倍以上)为28个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，CSBV感染后1个未知功能蛋白消失，CSBV感染后出现的蛋白分别为Hsp70、40S核糖体蛋白S3a、转移联合1型蛋白(MTA1)、Argonaute(AGO)蛋白、空泡H+—ATP酶和过氧化物酶。比较中蜂3日龄幼虫(意蜂王浆培养)和CSBV感染的3日龄幼虫蛋白图谱可知，差异蛋白点为4个(CSBV感染后2个消失，2个出现)，上调蛋白点(3倍以上)有9个，下调蛋白点(3倍以上)有14个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，CSBV感染后消失的蛋白为Hsp60和1个未知功能蛋白，出现蛋白分别为转录因子5A(eIF—5A)、磷酸丙糖异构酶1(TPI1)。蛋白分析表明，空泡H+—ATP酶和AGO蛋白可能与病毒感染有关。 比较意蜂3日龄幼虫(中蜂王浆培养)和CSBV感染的3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点有15个(CSBV感染后8个消失，7个出现)，上调蛋白点(3倍以上)有25个，下调蛋白点(3倍以上)有10个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，CSBV感染后消失的蛋白分别Hsp60(4个)、血影蛋白(Spectrin)和3个未知功能蛋白，出现的蛋白分别为3-磷酸甘油醛脱氢酶、过氧化氢酶、分子伴侣GroEL和4个未知功能蛋白。比较意蜂3日龄幼虫(意蜂王浆培养)和CSBV感染的3日龄幼虫的蛋白图谱可知，差异蛋白点有15个(CSBV感染后11个消失，4个出现)，上调蛋白点(3倍以上)有12个，下调蛋白点(3倍以上)有20个，差异蛋白点的质谱鉴定表明，CSBV感染后消失的蛋白分为别30核糖体蛋白(S3)、酪氨酰—tRAN合成酶、Hsp60(3个)、硫氧还蛋白过氧化物酶1、Aldo—keto还原酶(AKRs)、缩醛酶、分子伴侣GroEL(2个)和Hsp8，CSBV感染后出现的蛋白为二硫化物异构酶(PDI)和3个未知功能蛋白。蛋白分析表明，分子伴侣GroEL可能与病毒感染有关。 本研究首次对蜜蜂中肠上皮细胞成功进行了原代培养，为研究蜜蜂与病毒的交互作用提供了体外测定模型；同时研究了CSBV感染的中、意蜂营养杂交的3日龄幼虫蛋白图谱的变化，结果表明空泡H+—ATP酶、AGO蛋白和分子伴侣GroEL可能与病毒的感染机制有关。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章引言

1.1中蜂囊状幼虫病研究进展

1.2昆虫中肠生物防治及中肠细胞培养研究进展

1.3双向电泳技术及其在昆虫蛋白质组学研究中的应用

1.4论文研究的目的和主要内容

第2章中华蜜蜂中肠细胞原代培养

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.2.1蜜蜂中肠细胞原代培养的基本特征

2.2.2中肠细胞活性与增殖检测

2.2.3不同因子对细胞培养的影响

2.3讨论

2.4小结

第3章中蜂囊状幼虫病病原鉴定及感染

3.1材料和方法

3.2结果与分析

3.2.1中蜂囊状病RT-PCR检测

3.2.2中蜂囊状幼虫病病毒部分核酸序列测序

3.2.3中蜂囊状幼虫病病毒电镜观察

3.2.4中蜂2日龄幼虫取食E.coll(egfp)荧光观察

3.2.5中蜂2日龄幼虫取食P.luminescens H06虫体体色观察

3.2.6不同培养物及饥饿状念对中蜂2日龄幼虫死亡率影响

3.2.7中蜂2日龄幼虫取食CSBV病毒原液的RT-PCR检测

3.2.8中蜂2日龄幼虫取食CSBV病毒原液后的培养

3.3讨论

3.4小结

第4章CSBV感染中、意蜂营养杂交幼虫的蛋白质组分析

4.1材料和方法

4.2结果与分析

4.2.1蜂群常见六种病毒的RT-PCR检测

4.2.2中蜂幼虫营养杂交及CSBV感染其幼虫的双向电泳图谱分析

4.2.3意蜂幼虫营养杂交及CSBV感染其幼虫的双向电泳图谱分析

4.3讨论

4.3.1中、意蜂营养杂交幼虫的表达图谱差异显示分析

4.3.2 CSBV感染中、意蜂幼虫蛋白的表达图谱差异显示分析

4.4小结

总结

参考文献

在读期间发表论文

致谢

附录：英文缩略词表