eNOS-NO上调PGC-1α发挥内皮细胞保护作用的机制研究及丁基苯酞在其中的作用

摘要

目的：以大鼠主动脉内皮细胞(SVAREC)作为研究对象，进一步探讨NBP发挥保护作用的关键靶点。观察糖氧剥夺/复氧(OGD/R)条件下，作为独立于缺氧诱导因子HIF外的另一种促进血管增生的因子PGC-1α及其下游VEGF表达水平的变化，探讨其可能的调控机制。并且进一步观察NBP作用前后，内皮细胞活性变化、抗氧化损伤能力的改变、核损伤情况、以及细胞内PGC-1α、VEGF表达水平的变化等。拟初步探讨NBP在OGD/R条件下发挥细胞保护作用的具体机制，是否与保护eNOS、上调PGC-1α有关。以寻找NBP血管保护作用的具体靶点，更好地为缺血性脑血管病的治疗提供理论依据。 方法：⑴首先进行预实验，采用免疫荧光和Western—Blot的方法，观察NBP是否能增加OGD/R条件下内皮细胞中VEGF的表达；从而在细胞模型上验证其在大体模型上已经观察到的促血管增生现象。⑵机制探讨：实验中采用特异性的eNOS激动剂CaI和抑制剂L—NIO，分别促进和降低eNOS活性；用免疫荧光和Western—Blot的方法检测正常和OGD/R条件下内皮细胞中PGC-1α、VEGF表达水平的变化；从而证明eNOS—NO是否参与内皮细胞PGC-1α上游的表达调控。⑶采用特异性的eNOS激动剂CaI和抑制剂L—NIO，分别促进和降低OGD/R条件下 eNOS活性，采用Western—Blot的方法，观察NBP是否通过eNOS—NO对OGD/R条件下PGC-1α、VEGF的表达产生影响。⑷用MTT的方法检测细胞活性、测定OGD/R后细胞SOD酶活性的变化、以及核染色的方法验证NBP是否通过eNOS对OGD/R条件下内皮细胞产生保护作用。 结果：①免疫荧光及WB的结果均表明，NBP1.0μM能明显增加正常及OGD6h/R12h后内皮细胞内VEGF的表达。运用IPP图像处理软件，并进行统计学分析可以得出这种增高具有统计学意义。②从荧光图片上可以看到，PGC-1α这种转录激活因子主要在胞核内表达。外源性的NO donor SNAP并未使PGC-1α表达增高；而特异性eNOS抑制剂却能减低正常细胞中PGC-1α的表达。差异具有统计学意义。WB分析蛋白水平我们也得到类似的结果；说明eNOS—NO对正常内皮细胞中PGC-1α的表达至关重要。WB还发现PGC-1α下游的VEGF也存在着类似的变化趋势；即eNOS—NO对正常内皮细胞中VEGF的表达亦至关重要。③WB的结果表明，OGD6h/R12h后PGC-1α表达增高，使用了eNOS激动剂之后这种增高更加明显；而使用eNOS抑制剂之后，PGC-1α水平降至正常以下。其下游的VEGF也存在着同样的变化趋势。说明eNOS—NO能上调OGD/R条件下内皮细胞中PGC-1α、VEGF的表达。④WB的方法我们发现，NBP能使OGD/R条件下增高的PGC-1α表达进一步增多；具有统计学意义。而这种促进作用在用了eNOS抑制剂之后有所减低。可以看出NBP正是通过eNOS而起到上调PGC-1α的作用的。其下游的VEGF亦存在着类似的变化趋势。⑤OGD6h/R12h后内皮细胞SOD酶活性明显降低(约56％)；而用了NBP之后能很好的保护酶活性(上升约44.2％)；但这种保护作用在用了eNOS抑制剂之后消失。说明NBP抗氧化损伤的能力部分与eNOS相关。⑥OGD/R之后内皮细胞活性(MTT值)明显下降(约55％)；而NBP能使细胞活性上升约26％；同样的这种保护作用在运用了eNOS抑制剂之后减低(约23％)。⑦核染色的荧光图片上可以看到：正常细胞核圆形或类圆形、边界整齐、染色均匀。而OGD/R之后，胞核皱缩、核边界不整、核碎裂增多、染色浓染或聚集。加入了NBP之后能明显减轻这种核损伤改变。eNOS抑制剂则使NBP的保护作用消失。这种变化趋势具有统计学意义。 结论：⑾在体外内皮细胞模型上证明了NBP能上调OGD/R条件下血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管增生。⑵内源性eNOS—NO对正常内皮细胞PGC-1α、VEGF的表达至关重要；并在OGD/R条件下能上调两者的表达。⑶NBP通过保护eNOS，上调OGD/R条件下PGC-1α、VEGF的表达，从而实现其保护细胞活性、增强细胞抗氧化能力、减轻核损伤、促进血管增生的血管保护作用。

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