糖尿病血管平滑肌细胞线粒体钙调控对电压依赖性钙内流影响的研究

摘要

研究目的： 探讨15-16周糖尿病大鼠主动脉血管平滑肌细胞线粒体钙调控状况，以及线粒体的钙调控功能异常所导致的电压依赖性钙内流的幅度和速度上的改变。 研究方法： 将体重220g—250g的Wistar雄性大鼠随机分为糖尿病组和对照组，糖尿病组以一次性腹腔注射STZ(55mg/kg)诱导高血糖，对照组注射以等体积的枸橼酸钠溶液(0.1mol/L)。15-16周后，断颈处死大鼠，新鲜分离大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)，以荧光探针Fluo—3标记VSMC的胞浆钙，采用激光共聚焦显微镜扫描技术实时、动态地监测胞浆钙的变化情况。观察糖尿病组和对照组的由KCl诱发的经VDCC钙内流的幅度和速度，然后采用线粒体解藕剂CCCP和线粒体Uniporter摄取抑制剂钌红(Ruthenium red)破坏线粒体的钙调控功能，再观察电压依赖性钙内流的变化在两组之间有何不同，同时观察线粒体内钙含量的多少，并且对于所观察到的现象进行分析。 研究结果： 16周后，与对照组正常大鼠相比，糖尿病组大鼠的血糖明显升高，体重明显降低，糖尿病大鼠出现多饮，多食，多尿，体重增长缓慢，血糖水平高等典型症状。采用二步酶消化法新鲜分离主动脉平滑肌细胞可获得较多的VSMC，显微镜下可见细胞呈棒状、曲棍状、长条形或圆形，折光度强。采用台盼蓝拒染法检测细胞活性，测得活细胞的比率>95％。抗—平滑肌细胞肌动蛋白免疫荧光染色显示平滑肌细胞肌丝被染成绿色，证实所分离的细胞为VSMC。 在有钙液中，KCl可引起经VDCC的钙内流，引起胞浆钙的升高，与对照组相比，糖尿病组胞浆钙升高的幅度和速度都明显下降。在有钙液中，线粒体解藕剂CCCP能够破坏线粒体的膜电势，导致线粒体内的钙释放至胞浆，引起胞浆钙的升高，糖尿病组线粒体释放的钙明显多于对照组(P<0.01)，提示糖尿病状态下，线粒体可能存在钙超载。当反应恢复平稳后，KCl仍可引起钙内流，胞浆钙再次升高，而两组经VDCC的钙内流与未加入CCCP之前都有所减少，但对照组减少的更加明显，两组的差异性消失。以线粒体的Uniporter摄取抑制剂钌红预孵细胞10分钟，再用KCl刺激经VDCC的钙内流，此时观察胞浆钙的升高，两组的钙内流与未加入RR前相比都有所下降，但两组的差异性无显著性。以上结果提示，糖尿病状态下线粒体存在着钙超载，并且线粒体的钙摄取可影响经VDCC的钙内流的速度和幅度。 研究结论： 1.糖尿病状态下，在新鲜分离的主动脉平滑肌细胞上，经电压依赖性钙通道的钙内流，速度和幅度都明显减小。 2.糖尿病主动脉平滑肌细胞内，CCCP所引起的线粒体释放的钙与正常对照组相比明显增多，提示线粒体存在着钙超载。 3.以线粒体解藕剂或线粒体Uniporter摄取抑制剂破坏掉线粒体的功能后，两组电压依赖性钙内流幅度和速度都有所下降，正常组比糖尿病组下降的幅度更明显。提示线粒体的钙调控可影响经VDCC的钙内流的幅度和速度，并且线粒体的钙调控功能异常在糖尿病状态下电压依赖性钙内流的减少中起着重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一章前言

第二章材料与方法

2.1主要试剂：

2.2主要仪器：

2.3试剂配制：

2.4实验方法

2.5统计学分析

第三章结果

3.1糖尿病大鼠的血糖及体重变化

3.2新鲜分离胸主动脉平滑肌细胞的存活率及鉴定

3.3糖尿病状态下主动脉平滑肌细胞电压依赖性钙内流的变化

3.4抑制线粒体的钙调节能力对电压依赖性钙内流的影响

第四章讨论

4.1糖尿病模型的建立

4.2糖尿病状态下电压依赖性钙内流的改变

4.3糖尿病状态下线粒体的钙超载

4.4抑制线粒体的钙摄取对电压依赖性钙内流的影响

结 论

附表

附图

参考文献

致 谢