凡纳滨对虾NF-κB功能研究及对白斑综合症(WSSV)极早期基因1(IE1)转录调控

摘要

凡纳滨对虾，也叫太平洋白对虾(pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei)，是世界最重要的经济对虾之一。随着凡纳滨对虾养殖产量迅速增长，细菌性和病毒性引起的的疾病，尤其是白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)，日趋严重并且威胁着世界各产虾国的对虾产业。因此，研究对虾先天免疫，调查宿主病原之间的相互关系已成为当务之急，其也可为对虾养殖健康管理和疾病控制提供新的视角。 Rel/NF—кB转录因子在诸多重要生理或病理过程中都起着核心作用，如细胞凋亡、增殖、分化，而且还调控先天性和获得性免疫反应和应激反应相关基因表达的转录。果蝇中，已鉴定出三个Rel/NF—кB转录因子：Dorsal、Dif和Relish已经，其可调控下游效应因子如抗菌肽基因的转录。 直到目前，对虾先天免疫尤其是分子水平上的相关知识依旧所知甚少，仅有有限的免疫相关蛋白/基因已被报道参与对虾免疫应答。在此，我们报道鉴定了对虾的Rel/NF—кB转录因子，LvDorsal，LvRelish及其短的剪辑异构体sLvRelish。 利用简并引物扩增及5’和3’ cDNA末端快速扩增(RACE)，获得Rel/NF—кB在凡纳滨对虾中的同源基因，LvDorsal(GenBank accession No．FJ998202)，LvRelish(GenBank accession No．EF432734)及sLvRelish(GenBank accession No．FJ416146)，并通过基因组扩增获取了LvRelish基因结构(GenBank accession No．FJ416145)。 LvDorsal的cDNA序列全长为2193bp，开放阅读框有1200bp，编码400个氨基酸的蛋白(不包含终止子)。生物信息学分析表明，LvDorsal含有一个Rel同源性结构域(Rel homology domain，RHD)和一个核定位信号(nucleus localization signal，NLS)，属于NF—кB类型Ⅱ。LvRelish的cDNA序列全长为4071bp，开放阅读框有3624 bp，编码1207个氨基酸的蛋白，序列分析预测表明LvRelish的N端含有一个RHD结构域，一个NLS，C端则含有6个ANK(ankyrin repeat)结构域即IкB类似结构域和一个死亡结构域(Death domain，DD)，属NF—KB类型Ⅰ。sLvRelish的cDNA序列全长为1054 bp，开放阅读框有951 bp，编码317个氨基酸的蛋白，sLvRelish跟LvRelish在RHD结构域中有273aa相同，包含RHD大部分，但没有NLS，ANK和DD。所扩增的LvRelish基因组序列约15 kb，其基因组结构共有22个外显子，包含LvRelish的几乎全部和sLvRelish的全部cDNA序列。 逆转录PCR(RT—PCR)表明LvDorsal和LvRelish的mRNA在各组织表达有所不同。LvRelish和sLvRelish在同一组织，两者表达水平基本类似，两者在不同组织之间表达水平量都变化较大，而LvDorsal组织分布表达则相对比较均一。鳃组织Northern blot可检测出LvRelish，但未能检测出LvDorsal。Western blot分析表明在S2细胞中表达的LvRelish可被剪切成两部分，且N端可入核。免疫荧光分析也表明LvDorsal和LvRelish产物可以入核。通过EMSA实验，显示LvDorsal和LvRelish的RHD在体外可结合果蝇抗菌肽кB基序，证实LvDorsal和LvRelish为NF—кB转录因子。利用EMSA实验进一步证明LvRelish的RHD可结合凡纳滨对虾抗菌肽penaeidin—4调控区域的кB基序。此外，通过构建果蝇pGL3Attacin及pGL3Drosomycin和凡纳滨对虾抗菌肽penaeidin—4报告基因载体，利用双荧光素酶报告系统表明LvDorsal，LvRelish和LvSTAT可调控凡纳滨对虾抗菌肽penaeidin—4。 另外，利用EMSA实验表明LvRelish的RHD可结合WSSV极早期基因1(IE1)5’上游调控区的кB基序，报告基因检测显示除了LvSTAT，LvRelish、LvDorsal和LvJUN激活调控也都可激活IE1报告基因，表明WSSV的IE1基因很可能依靠宿主细胞转录和翻译机制。

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论文说明：缩略词

声明

第一章前言综述

1.1对虾养殖及其病害

1.1.1国际对虾养殖概况

1.1.2我国对虾养殖业概况及凡纳滨对虾养殖状况

1.1.3对虾病害概况

1.2对虾先天免疫系统研究进展

1.2.1屏障系统

1.2.2先天免疫反应系统

1.2.3对虾基因组学研究

1.3 WSSV研究进展

1.3.1 WSSV形态结构及理化性质

1.3.2 WSSV基因组与基因功能

1.3.3 WSSV形态发生和生物学特征

1.3.4 WSSV宿主范围和传播

1.3.5 WSSV检测及防控

1.4本研究目的和意义

第二章凡纳滨对虾NF-κB基因克隆及序列分析

2.1材料与方法

2.1.1实验材料与试剂

2.1.2简并引物获取LvDorsal和LvRelish cDNA片断

2.1.3 LvDorsal和LvRelish的5’和3’末端快速扩增(RACE)

2.1.4 LvRelish基因组扩增

2.1.5生物信息学分析

2.2结果与分析

2.2.1全长序列的生物信息学分析

2.2.2 LvRelish基因组结构分析

2.2.3 LvDorsal和LvRelish与其他物种相应结构域对比分析

2.3讨论

2.4小结

第三章凡纳滨对虾NF-κB的mRNA转录分析

3.1材料与方法

3.1.1实验材料与试剂

3.1.2逆转录PCR(RT-PCR)组织分布检测

3.1.3实时定量(QT-PCR)分析

3.1.4 Northern blot

3.2结果与分析

3.2.1 LvDorsal、LvRelish及sLvRelish的RT-PCR组织分布

3.2.2 QT-PCR分析

3.2.3 Northern分析

3.3讨论

3.4小结

第四章凡纳滨对虾NF-κB细胞定位及其对果蝇κB序列的结合

4.1材料与方法

4.1.1实验材料与试剂

4.1.2 pAc表达载体载体构建

4.1.3果蝇S2细胞培养及转染

4.1.4 Western blot检测

4.1.5 NF-κB转录因子在S2细胞中的定位

4.1.6凝胶迁移或电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)实验

4.2结果与分析

4.2.1表达蛋白Western blot分析

4.2.2果蝇S2细胞核定位

4.2.3 EMSA实验分析

4.3讨论

4.4小结

第五章凡纳滨对虾NF-κB对抗菌肽基因的转录调控

5.1材料与方法

5.1.1实验材料与试剂

5.1.2抗菌肽报告基因载体及其他表达载体构建

5.1.3表达载体与抗菌肽报告基因载体S2细胞共转染

5.1.4双荧光素酶报告基因检测

5.1.5 EMSA实验

5.2结果与分析

5.2.1双荧光素酶报告基因检测结果分析

5.2.2 EMSA实验分析

5.3讨论

5.4小结

第六章凡纳滨对虾NF-κB对WSSV极早期基因1(IE1)的转录调控

6.1材料与方法

6.1.1实验材料与试剂

6.1.2 IE1报告基因载体构建及其他表达载体构建

6.1.3双荧光素酶报告基因检测

6.1.4 EMSA实验

6.2结果与分析

6.2.1双荧光素酶报告基因检测结果分析

6.2.2 EMSA实验分析

6.3讨论

6.4小结

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢