对虾白斑综合症病毒(WSSV)膜蛋白VP12和VP150的功能研究以及病毒极早期基因RNA干扰的初步研究

摘要

对虾白斑综合症病毒(WSSV)隶属于线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属（Whispovirus），是一种无包涵体、具双层囊膜、杆状型的双链环状DNA病毒。该病毒宿主范围很广，对虾、螯虾、蟹类等甲壳类都会被其侵染，而且传染力强，致死率高，难防治，不仅严重危害对虾养殖，还会对水生态环境构成威胁。病毒结构蛋白不仅有保护其遗传物质的功能，而且在感染过程中起决定性作用。本文围绕着WSSV结构蛋白开展研究。此外，还对其极早期基因开展了RNAi实验。具体内容主要包括了以下3个方面: (1) VP12是由病毒基因wsv009编码的一个低丰度蛋白。在本实验室早期的研究中，发现VP12存在于病毒的膜蛋白部分。为了进一步证实此结果，本文对该蛋白进行了原核表达，制备了VP12的多克隆抗体。利用此抗体进行Westernblot和免疫电镜分析，结果证实VP12的确存在于膜蛋白部分中，并且推测其可能位于囊膜的内侧。利用CO-IP实验和Far-western blotting的方法，我们首先确认了膜蛋白复合体VP12/VP150的存在，继而，证明该复合体通过VP12与病毒衣壳蛋白VP51的相互作用结合在核衣壳上。上述结果进一步证明VP12存在于WSSV囊膜内侧，另一方面说明VP12在病毒的包装过程中可能起到连接蛋白的作用，将病毒的囊膜和核衣壳联系起来。进一步的研究表明VP12能和连接蛋白VP26相互作用。基于VP12可以通过分子间形成二硫键实现自身聚合的实验结果，我们推测VP12可能通过其与自身以及与VP26的相互作用起到稳定完整病毒粒子的作用。 (2)由于病毒结构蛋白的相互作用是以立体交叉的网络形式存在，因此在第一部分的基础上，我们尝试寻找与VP150相互作用的蛋白。通过CO-IP分析，我们发现VP150可以和WSSV的主要结构蛋白之一的VP28相互作用，其作用位点存在于VP150的N端第1-206个氨基酸之间。Far-western blotting分析表明，在天然状态下，VP28的确能和全长的VP150相互作用，推测VP150可能从其N端开始降解。结合第一部分的结果，我们可以得出结论复合体VP12/VP150通过与VP28的相互作用结合在更大的膜蛋白复合体上，这样就形成了一个横跨囊膜和核衣壳的立体网络结构。 (3)利用RNA干扰技术，对wsv051等7个极WSSV早期基因进行了基因沉默实验。结果表明wsv051和wsv083对应的dsRNA抑制相应的基因的转录效果最好。实时荧光定量PCR结果显示，与阴性组或阳性组相比，基因特异的dsRNA具有较强的抑制WSSV增殖的作用(P＜0.05）。这些结果表明用RNA干扰的方法研究WSSV的极早期基因功能的思路是可行的，也为进一步研究WSSV极早期基因的功能提供了新的思路。 综上所述，本文通过对于WSSV病毒的结构蛋白VP12和VP150的性质以及与它们相互作用的其它蛋白的研究，以及极早期基因RNA干扰的研究，为进一步了解病毒的入侵、包装、成熟以及释放提供了重要基础知识，为病毒的防治提供有效科学的依据。

目录

声明

缩略词

摘要

前言

1．对虾白斑综合症病毒(WSSV)及其分子生物学研究现状

1．1 对虾白斑病(White Spot Disease，WSD)简介

1．2 对虾白斑综合症病毒的研究概况

1．3 对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因组学研究概况

1．4 对虾白斑综合症病毒的蛋白质组学研究

2．蛋白质相互作用主要的研究技术

3 RNA干扰的概况

3．1 RNA干扰的发现及其作用机制

3．2 RNA千扰在对虾病毒研究中的应用

4、本论文的研究目的、内容和意义

第一部分：WSSV膜蛋白VP12的功能研究

1 研究背景

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 wsv009结构分析

3．2 wsv009在感染过程中的转录时相分析

3．3 表达质粒pET-His-VP12的构建和鉴定

3．4 重组VP12蛋白的表达和纯化

3．5 Western blotting分析VP12蛋白在病毒粒子中的定位

3．6 VP12的免疫电镜定位

3．7 pET-V5-VP150N、pET-V5-VP150M和pET-V5-VP150C的构建和鉴定

3．8 Co-Immunoprecipitation分析验证VP12和VP150之间的相互作用

3．9 VP12和衣壳的体外共沉淀实验

3．10 Far-Western blotting分析VP12与VP51的相互作用

3．11 Co-Immunoprecipitation分析验证VP12和VP51之间的相互作用

3．12 VP12的自身相互作用

3．13 Far-western blotting证明VP12与VP26的相互作用

3．14 Co-Immunoprecipitation分析验证VP12和VP26之间的相互作用

4 讨论

第二部分 WSSV膜蛋白VP150的功能研究

1 研究背景

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP28之间的相互作用

3．2 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP24之间的相互作用

3．3 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP26之间的相互作用

3．4 Co-Immunoprecipitation分析验证VP150和VP19之间的相互作用

3．5 重组蛋白His-GST和His-VP28的表达和纯化

3．6 Far-Western blotting分析VP150与VP28的相互作用

4 讨论

第三部分 WSSV极早期基因的RNA干扰初步研究

1 研究背景

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果

3．1 dsRNA的体外合成

3．2 实时荧光定量PCR分析dsRNA对WSSV增殖的抑制作用

3．3 逆转录PCR分析特异性dsRNA对病毒相应基因转录的抑制作用

4 讨论

参考文献

附录 主要仪器设备、常规溶液配制和常规实验方法

1 主要仪器设备

2 常用溶液及培养基的配制

3 常规实验方法

博士期间发表的文章

致谢