锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白的功能研究

摘要

锯缘青蟹Mud crab(Scylla serrata)是我国重要的海水养殖品种，在东南沿海地区广泛养殖，病毒是锯缘青蟹Mud crab养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失。2004年始在珠海发现患“嗜睡病”(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒：锯缘青蟹双顺反子病毒(Mud crab dicistriviurs，MCDV)和呼肠孤病毒(mud crab reovirus，MCRV)。MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)。其单独存在就可以使锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80％以上。其全基因组测序于2007年在本室完成。
　　 本文从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV，电镜观察发现其直径为20-30nm，球形，无囊膜，呈二十面体对称，在CsCl中的浮力密度为1.32-1.36g/cm3。核酸性质分析发现此病毒基因组为单股正链RNA病毒ssRNA(+)。对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两个开放读码框ORF1和ORF2。ORF1编码非结构蛋白；ORF2编码结构蛋白，它是由分子量分别为53KD、35KD和22 KD的VP1，VP2，VP3三个结构蛋白组成。该病毒具有双顺反子病毒科的典型特征。
　　 为了研究MCDV的感染机制、致病性以及在青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，本文首次对这种ssRNA(+)病毒的三个结构蛋白进行了如下研究：
　　 首先对MCDV的基因组进行了生物信息学分析，并对其编码蛋白进行了保守结构域的功能预测。在病毒分离纯化的基础上，对三个结构蛋白的N端氨基酸进行了测序，与MCDV的基因组序列对比和结构分析均在基因组中找到了三个结构蛋白的相应位置。进行了病毒结构蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析研究。其次制备了MCDV全病毒单克隆抗体(McAbs)，用杂交瘤细胞上清ELISA、Western blot及原代培养的蟹细胞接种MCDV后的免疫荧光检测等方法进行了MCDV全病毒单克隆抗体的筛选，筛选到了抗VP1、VP2的单克隆抗体。对衣壳蛋白VP3基因的克隆、表达与重组蛋白的单克隆抗体制备及特性研究，得到了抗VP3的单克隆抗体。然后进行了MCDV单克隆抗体的应用研究：对以上所有识别MCDV三个结构蛋白质的11株单克隆抗体进行纯化与亚型分类后，建立了锯缘青蟹病毒感染组织石蜡切片的免疫荧光病理诊断方法，结果发现肝胰腺的肝小管内病变处有明显的阳性信号。为了鉴定这三个蛋白是否为病毒结构蛋白，单克隆抗体免疫电镜结果发现MCDV的单抗所识别的抗原决定族定位在病毒粒子的边缘，从而进行了明确的定位鉴定，同时证实了三个蛋白均为病毒衣壳蛋白。MCDV的单抗与其它8种水生病毒以及人类单股正链RNA病毒的13种小RNA病毒科的病毒进行交叉实验，发现MCDV的单抗与其它水生动物病毒及这13种小RNA病毒均无交叉反应，证明制备的MCDV单抗特异性好。最后建立了两种双抗体夹心ELISA免疫学快速诊断方法，并应用单抗进行了锯缘青蟹体内中和试验，检测单克隆抗体对蟹的中和保护作用，结果表明，MCDV结构蛋白的单克隆抗体对感染MCDV的锯缘青蟹有一定的保护作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1单股正链RNA病毒

1.2水生动物病毒及其病毒病研究进展

1.3单克隆抗体在水生动物病毒研究中的应用进展

1.4本研究的目的和意义

第二章锯缘青蟹MCDV生物信息学分析和结构蛋白鉴定

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三章MCDV单克隆抗体的制备及其特性分析

3.1材料

3.2方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5小结

第四章MCDV的VP3克隆表达与重组蛋白的单抗制备及特性研究

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章抗MCDV单克隆抗体免疫学诊断方法的应用研究

5.1材料

5.2方法

5.3结果

5.4讨论

5.5小结

第六章抗MCDV单抗在蟹体内中和保护作用的研究

6.1材料

6.2方法

6.3结果

6.4 讨论

6.5小结

全文总结

参考文献

附 录

发表论文情况

致谢