发光杆菌Photorhabdus luminescens LN2种间特异杀线虫活性的分子机制

摘要

发光杆菌属Photorhabdus和嗜线虫致病杆菌属Xenorhabdus细菌分别与昆虫病原线虫异小杆属Heterorhabditis和期氏属Steinernema互惠共生，是一类杀虫谱广、毒性强的昆虫病原细菌。共生细菌P．luminescens LN2对异小杆线虫H．bacteriophora H06具有杀线虫活性，共生细菌对非特异共生线虫产生的种间杀线虫作用影响多种线虫共感染昆虫寄主的竞争效果。本论文采用Tn5转座及利福平抗生素诱变方法构建共生细菌P．luminescens LN2突变库；分离和鉴定LN2细菌与杀线虫活性相关的基因；测定耐利福平菌株rpoB基因的突变规律及对致死H．bacteriophora H06线虫作用的影响；同时分析野生型与突变菌株的蛋白质组，为从DNA和蛋白水平研究P．luminescens LN2细菌对H.bacteriophora H06线虫的种间特异杀线虫活性的分子机制提供数据。论文取得了以下三部分结果： 首先，采用Tn5转座诱变的方法构建了共生细菌P.luminescens LN2的转座突变库，经筛选获得杀线虫缺陷菌株1株；Southern blot结果表明Tn5以单一拷贝形式转座插入突变株的基因组；获得与杀线虫活性相关的基因namA及其侧翼序列共9586 bp，该序列包含6个ORFs，其中5个以50％以上的相似性分别同源于dam，repA，dcm，gpQ，gpP基因，而Tn5插入位点大小为1095 bp的namA基因则编码364个氨基酸的新蛋白质。namA基因的功能互补实验证实了namA基因参与了共生细菌LN2对H06线虫的杀线虫活性。namA基因的突变菌株未改变在染料吸收、色素与荧光产生等方面的生理生化特征及对大蜡螟的注射毒性，也未能定殖于H06感染期线虫肠道。RT—PCR结果表明，在12-48 h培养时段，野生型菌的namA基因均有转录。经PCR和Southern blot检测，namA为LN2细菌的特有基因。将namA基因表达于pET—30a(+)原核系统，经SDS—PAGE和Western blot印迹分析，重组蛋白于胞内形成包涵体蛋白；复性后的重组蛋白NamA对H06感染期线虫没有毒性作用，说明NamA蛋白对H06感染期线虫可能没有直接的杀线虫活性，或是复性后的重组蛋白未能正确折叠功能结构。 其次，通过利福平诱变获得LN2细菌的两类耐利福平菌株：一类对H06线虫具有杀线虫活性，另一类则可支持H06线虫的繁殖。这些突变菌株在染料吸收、色素与荧光产生及对大蜡螟的注射毒性方面上与野生菌株没有明显差异；耐利福平菌株的rpoB基因都发生了突变；同源互换结果显示，rpoB基因的突变位点决定突变株对H06线虫的致死作用，如第146个氨基酸由V转换为F、或第512个氨基酸由S转换为F、或第513个氨基酸由Q转换K、或第313和529位点同时突变都使突变株支持H06线虫的繁殖，而第564个氨基酸由P突变为L时耐利福平菌株均可致死H06线虫；namA突变株对利福平敏感且rpoB基因未发生突变。支持H06线虫繁殖的耐利福平突变菌株未能定殖H06感染期线虫肠道，但可定殖LN2感染期线虫肠道。 最后，以双向电泳技术分析了LN2野生型菌株、namA突变株及rpoB基因不同突变株的蛋白质组，检测到蛋白质点约为914-939个，经图谱差异分析与MALDI—TOF—MS质谱鉴定，获得差异表达的蛋白质58个。根据生物学功能，差异表达的蛋白可分为13类：(1)核糖体蛋白(4/58)；(2)压力应答蛋白(3/58)；(3)次生代谢物(4/58)；(4)氨基酸代谢及相关分子(9/58)；(5)核苷类与核苷酸类的生物合成与代谢(7/58)；(6)细胞壁、膜合成(3/58)；(7)运输与结合蛋白(5/58)；(8)信息与调控路径(6/58)；(9)能量产生与转换(5/58)；(10)噬体菌相关蛋白(4/58)；(11)翻译后修饰(1/58)；(12)鞭毛蛋白(1/58)；(13)未知蛋白(6/58)。推测参与杀线虫活性的蛋白包括：ATP依赖性的RNA解旋酶RhIE、Ⅲ型分泌系统类蛋白、二硫异构酶DsbA及一个功能未知蛋白。 本论文结果为进一步阐明共生细菌与线虫之间的共生和营养专化性机理提供了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章前言

1.1昆虫病原线虫及其共生细菌

1.1.1昆虫病原线虫—共生细菌系统及其生活史

1.1.2共生细菌与昆虫病原线虫的共生性

1.2利福平耐药性与rpoB基因的突变

1.2.1 RNA聚合酶

1.2.2利福平的作用机制

1.3蛋白质组学研究进展

1.3.1蛋白质组学的基本概念

1.3.2蛋白质组学的研究技术

1.3.3发光杆状菌的蛋白质组学研究进展

1.4本论文的研究目的和研究内容

1.4.1研究目的

1.4.2研究内容

第二章共生细菌P.luminescens LN2杀线虫活性相关基因的筛选与功能研究

2.1实验材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2质粒与菌株

2.1.3实验动物

2.1.4主要试剂

2.1.5培养基与常用试剂的配制

2.2技术路线

2.3实验方法

2.3.1 DNA基因操作方法

2.3.2共生细菌LN2杀线虫缺陷菌株的筛选及其验证

2.3.3共生细菌LN2与杀线虫相关基因的测序与序列分析

2.3.4共生细菌LN2与杀线虫相关基因的克隆与功能互补研究

2.3.5 namA基因的功能测定与研究

2.3.6 namA基因在不同培养时间的转录情况

2.3.7 namA基因在其它昆虫病原细菌的存在情况

2.4实验结果

2.4.1共生细菌LN2杀线虫缺陷菌株的筛选及其验证

2.4.2共生细菌LN2与杀线虫相关基因的测序与序列分析

2.4.3共生细菌LN2与杀线虫相关基因的克隆与功能互补研究

2.4.4 namA基因的功能测定与研究

2.4.5 namA基因在不同培养时间的转录情况

2.4.6 namA基因在其它昆虫病原细菌的存在情况

2.5讨论

2.6本章小结

第三章rpoB基因的突变对共生细菌LN2杀H06线虫活性的影响

3.1实验材料

3.1.1主要仪器设备

3.1.2质粒与菌株

3.1.3主要试剂

3.1.4培养基和常用试剂的配制

3.2技术路线

3.3实验方法

3.3.1共生细菌LN2耐利福平菌株的筛选与生理研究

3.3.2共生细菌LN2耐利福平菌株H06线虫的生物测定

3.3.3耐利福平菌株对昆虫大蜡螟的注射毒力测定

3.3.4共生细菌LN2耐利福平菌株rpoB基因的序列测定与分析

3.3.5共生细菌LN2的rpoB基因的同源互换实验

3.3.5细菌LN2耐利福平菌株对H06线虫的定殖能力的研究

3.4结果与分析

3.4.1共生细菌LN2耐利福平菌株的筛选与生理研究

3.4.2共生细菌LN2耐利福平菌株对H06线虫的生物测定

3.4.3耐利福平菌株对昆虫大蜡螟的注射毒力测定

3.4.4共生细菌LN2耐利福平菌株rpoB基因的序列测定与分析

3.4.5共生细菌LN2的rpoB基因的同源互换实验

3.4.6共生细菌LN2耐利福平菌株对H06线虫的定殖能力的研究

3.5讨论

3.6本章小结

第四章 namA突变株及耐利福平菌株的蛋白质组分析

4.1实验材料

4.1.1主要仪器设备

4.1.2实验菌株

4.1.3主要试剂

4.1.4试剂的配制

4.2技术路线

4.3实验方法

4.3.1样品制备

4.3.2第一向等电聚焦(IEF)

4.3.3胶条平衡

4.3.4第二向SDS-PAGE电泳

4.3.5凝胶的染色及检测

4.3.6图像采集与图谱分析

4.3.7差异蛋白点的切取

4.3.8胶内酶解

4.3.9质谱分析

4.3.10数据库检索

4.4结果与分析

4.4.1蛋白质双向电泳及其图谱分析

4.4.2差异表达的蛋白质点的MALDI-TOF-MS质谱分析与鉴定

4.4.3突变后表达量变化趋势一致的差异蛋白

4.4.4与杀线虫活性相关的蛋白质

4.5讨论

4.5.1蛋白质组学研究技术

4.5.2差异表达蛋白

4.6本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间已发表或待发表学术论文