利用rDNA序列对刺激隐核虫、多子小瓜虫相关生物学特性研究

摘要

多子小瓜虫(Ichthyophthiorus multifiliis)和刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是目前经济鱼类养殖业最为普遍和危害性最大的两种寄生性纤毛虫。近年来，这两种纤毛虫给淡水和海水养殖业造成了巨大的经济损失。这两种寄生虫主要感染鱼皮肤和鳃，分别引起淡水和海水鱼类的“白点病”。本论文将从分子生物学角度，利用核糖体DNA(rDNA)基因序列对这两种寄生虫相关生物学特性进行分析，同时利用其种间的遗传差异性，对虫体及其内共生体进行鉴定，这将对这类纤毛虫的系统发育、诊断和基础生物学研究具有重要意义。 本论文分为四个部分： 1.刺激隐核虫rDNA ITS遗传标记的研究 2.利用rDNA ITS序列建立特异PCR检测方法 3.利用16S rDNA基因序列分析纤毛虫的内共生体 4.内共生体的定位及功能研究 本研究从分子遗传学角度出发，通过对不同地区多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis，Ich)和刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的ITS-1及ITS—2进行PCR扩增和序列分析，确定其种间和种内差异性，以明确ITS-1及ITS—2是否可作为小瓜虫分子生物学分类的遗传标记。结果发现：来自不同地区的C.irritans的ITS-1和ITS—2序列差异性分别为0～1.6％和0～2.1％，而C.irritans与I.multifiliis之间的ITS-1和ITS—2之间的差异性分别为50.1～51.3％和52.6～53.3％，各地理株C.irritans和I.multifiliis的5.8S均不存在序列差异性，由此，我们成功的确立了ITS作为鱼类小瓜虫遗传标记的地位，并且ITS—2相对于ITS-1更为敏感，为C.irritans的分子生物学的进一步研究奠定了基础。 根据已经测得的C.irritans和I.multifiliis核糖体序列，通过网上Blast比对分析，设计、合成了针对C.irritans和I.multifiliis的特异性引物P1-S15和S01-S02，通过PCR条件优化和扩增后，他们均能特异的扩增出目的DNA片段，分别是540bp和280bp，其他对照样品均未见扩增出特异片段。敏感性试验可以检测到最低浓度为45pg/ul。通过冻融方法和巢式PCR敏感性可以检测到单个的幼虫，该方法特异性强、敏感性较高、重复性好，不仅可用于C.irritans和I.multifiliis的分类鉴定，也可用于它们所导致的寄生虫病的诊断和流行病学调查。 在同一物种中，核糖体16S相对保守，可以作为种间鉴定的标记序列。本研究通过16S rDNA序列的扩增、克隆、分析首次获得了多子小瓜虫I.multifiliis的内共生体序列。通过生物学软件应用分析获得的16S序列，成功的发现这些序列与I.multifiliis的18S序列截然不同，而与Flavobacterium家族，Ricketsiales家族和Bacteroidetes家族这三个细菌的基因家族存在着非常高的相似性。由此，我们成功的通过16S rDNA基因序列首次获得了I.multifiliis的三种内共生体。 在上面研究的基础上，根据已经获得的内共生体16S rDNA序列，通过网上比对，寻找其特异的基因区间，设计特异的DNA探针，通过荧光原位杂交技术(FISH)成功地确定其在I.multifiliis体内的位置，与大多数的纤毛共生体相似，位于I.multifiliis的胞质中，电镜观察结果同样证实内共生体分布在I.multifiliis报纸中，而非胞器内。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1发现和命名

1.2分类地位

1.3生活史

1.4宿主的特异性和地理分布

1.5流行病学调查

1.6实验室培养

1.7研究动态

1.7.1致病机理

1.7.2治疗方法

1.8本论文的研究目标

第二章刺激隐核虫rDNA ITS序列差异的研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验样品

2.2.2试剂

2.2.3样品材料的处理和DNA提取

2.2.4 PCR扩增

2.2.5琼脂糖电泳分析

2.2.6测序样品PCR扩增产物的回收与纯化

2.2.7 ITS序列的测定

2.2.8 DNA序列分析

2.3结果

2.3.1 PCR扩增结果

2.3.2 DNA测序与序列分析

2.3.3序列差异性分析及遗传关系分析结果

2.3.4序列上传获得的GenBank序列号

2.4讨论

第三章利用rDNA ITS序列建立特异PCR检测方法

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1虫体样本

3.2.2酶类及主要试剂

3.2.3主要仪器设备

3.2.4样品材料的处理和DNA提取

3.2.5样品ITS PCR扩增

3.2.6样品特异PCR扩增

3.2.7巢式PCR

3.2.8特异性实验

3.2.9测序分析

3.2.10敏感性试验

3.2.11水体检测

3.3结果

3.3.1虫体ITS扩增结果

3.3.2特异PCR扩增结果和测序分析

3.3.3敏感性试验

3.3.4水体检测结果

3.4讨论

第四章利用16S rDNA基因序列分析多子小瓜虫的内共生体

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1实验样品

4.2.2主要试剂

4.2.3溶液与培养基

4.2.4主要仪器设备

4.2.5样品的DNA提取

4.2.6内共生体16S的PCR扩增

4.2.7琼脂糖电泳分析

4.2.8 PCR产物的纯化回收

4.2.9 PCR纯化产物的连接与转化

4.2.10重组质粒的鉴定

4.2.12 16S rDNA的序列测定

4.2.13 16S rDNA序列的分析

4.3结果

4.3.1 PCR扩增结果

4.3.2 16S rDNA的克隆与鉴定结果

4.3.3重组质粒PCR鉴定及酶切鉴定

4.3.4.DNA测序结果与序列分析

4.4讨论

第五章小瓜虫内共生体的定位及功能研究

第一节利用16S rDNA探针和荧光原位杂交技术分析内共生体细胞内位置

5.1.1前言

5.1.2材料与方法

5.1.3结果

5.1.4讨论

第二节内共生体功能的初步研究

5.2.1前言

5.2.2材料与方法

5.2.3结果

5.2.4讨论

结语

参考文献

附录

致谢