苏云金芽孢杆菌噬菌体MZTP02c基因组文库的构建及保藏研究

摘要

本文通过用丝裂霉素C(MMC)诱导苏云金芽孢杆菌溶原性生产菌株MZ1-H3ab，从裂解液中分离到一株基因组大小约为40 kb的温和噬菌体MZTP02末端突变株MZTP02c。运用构建酶切片段质粒文库和PCR的方法，构建了一个覆盖该突变体基因组95％以上遗传信息的DNA文库，并进行了生物信息学分析。由于实验过程中发现噬菌体MZTP02c的滴度(titer)下降十分迅速，因此同时研究了不同温度下MZTP02c混合甘油、DMSO、氯仿等稳定剂时活力保持情况。 通过9轮空斑纯化MMC诱导MZ1-H3ab释放的噬菌体，得到一株生物学性状一致的噬菌体。由子MZ1-H3ab可能含有2株噬菌体，MZTP01和MZTP02.因此分别用MZTP02和MZTP01的特异基因tmp、mur、pep和ogr进行PCR鉴定，结果显示特异扩增条带序列和tmp、mur完全一致，因此推测所得到的噬菌体可能来源于MZTP02，并命名为MZTP02c。SDS—PAGE分析MZTP02c结构蛋白组成，结果显示只有4个条带与MZTP02一致。MZTP02c结构蛋白组成大致为：34 kDa和37 kDa两条主带，24 kDa、26 kDa和28 kDa三条次主带，49 kDa、55kDa、70 kDa和85 kDa四条次带。继而进行的基因组DNA酶切图谱分析也显示出MZTP02c在基因组大小和DNA序列上与MZTP02有极大的差异。 将基因组酶切片段克隆到载体上，构建了含有14个酶切片段的质粒文库。运用DNASATR和DNAMAN生物软件拼接后，得到了26 kb、SphI/BamHI—4 kb、XbaI—3 kb和BamHI/EcoRI-1.5 kb四个独立的片段，总计约35 kb。运用DNASTAR MEGLINE软件进行比对，发现MZTP02c和MZTP02 DNA序列的42 bp～15313 bp完全相同，但是MZTP02c在5’端和3’端继续向2个方向延伸了大约20 kb。 再通过在四个独立片段两端设计引物，两两之间进行PCR扩增连接。最后文库序列拼接得到MZTP02c30，054 bp主体片段，1586 bp和3342 bp2个未拼接的酶切片段以及2485 bp、899 bp和725 bp三个单端特异PCR扩增片段。一共涵盖MZTP02c DNA信息38.782 kb。 生物信息学分析显示，MZTP02c基因组文库DNA序列GC含量为36.31％．BLASTN同源序列联配比较表明，MZTP02c和三个蜡状芽孢杆菌B．cereus G9842(27％)，B．cereus B4264(27％)以及B．cereusATCC14579(19％)基因组同源性最大。而较噬菌体基因组而言，Bacillus phage IEBH(4％)和Bacillus anthracis pbage Gamma isolate53(3％)是与MZTP02c同源性相对高的2个噬菌体。 应用生物信息学软件预测文库DNA序列包含53个ORFs，7个启动子，向正反两个方向进行转录，其中17个ORFs含有蛋白保守区域。MZTP02c基因组结构可分为五个功能模块，从5’到3’依次为：DNA复制、转录控制、DNA包装、噬菌体粒子装配和细胞裂解。可能与噬菌体溶原性相关的蛋白主要有，DNA复制终止蛋白、DNA修复ATPase、dUTPase、RNA聚合酶组分以及DNA聚合酶DnaD组分等。 为了研究MZTP02c的最佳保藏方法，把从平板上收集的噬菌体悬液进行简单的离心分离纯化，再加入25％甘油、7％DMSO或1％氯仿作为保藏稳定剂，在4℃、—20℃和—80℃下进行正交保藏实验。同时尝试将噬菌体和敏感宿主H25在37℃温浴吸附后再加入稳定剂的保藏方法。结果显示在—80℃条件下，采用7％DMSO作稳定剂，同时使噬菌体MZTP02c预先和宿主细胞吸附的保存方法效果良好，可使MZTP02c一年之内滴度下降幅度从初始4℃保藏下降107 PFU/ml优化到一年只下降3×102 PFU/ml。

目录

文摘

英文文摘

前言

论文说明：略缩词

声明

第一章文献综述

1.1引言

1.2苏云金芽孢杆菌噬菌体研究概述

1.2.1噬菌体简介

1.2.2苏云金芽孢杆菌噬菌体

1.3苏云金芽孢杆菌噬菌体分子生物学研究进展

第二章实验仪器与材料

2.1主要仪器

2.2实验材料

2.2.1菌种及质粒载体

2.2.2主要试剂

2.2.3主要溶液的配制

第三章噬菌体的纯化和基因组DNA鉴定

3.1方法

3.1.1溶原性噬菌体的诱导

3.1.2双层培养基平板鉴定及纯化溶原性噬菌体

3.1.3噬菌体滴度的测定

3.1.4噬菌体的固体扩增和收集

3.1.5噬菌体的液体大量扩增和收集

3.1.6噬菌体的纯化

3.1.7噬菌体DNA的提取

3.1.8噬菌体DNA QIAGEN公司试剂盒提取方法

3.1.9噬菌体DNA的PCR鉴定

3.1.10目的DNA片断的分离纯化

3.1.11 PCR产物与T载体的连接

3.1.12 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

3.1.13热激转化法

3.1.14质粒DNA的提取与纯化

3.1.15 pMD18T-tmp,pMD18T-mur质粒DNA酶切以及测序鉴定

3.1.16噬菌体DNA的酶切图谱分析

3.1.17 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3.2结果与分析

3.2.1丝裂霉素C(MMC)诱导溶原性宿主菌MZ1-H3ab实验结果分析

3.2.2双层平板法纯化噬菌体结果分析

3.2.3固体和液体噬菌体MZTP02c扩增实验结果分析

3.2.4噬菌体MZTP02c基因组提取结果及电泳分析

3.2.5噬菌体MZTP02c纯化病毒粒子SDS-PAGE鉴定结果分析

3.2.6噬菌体MZTP02c基因组PCR鉴定

3.2.7噬菌体MZTP02c基因组单酶切鉴定结果分析

3.3讨论

3.4小结

第四章噬菌体MZTP02c基因组文库的构建

4.1方法

4.1.1噬菌体MZTP02c基因组DNA酶切

4.1.2基因组酶切DNA片段分离纯化

4.1.3基因组酶切DNA片段连接载体

4.1.4 Cacl2法制备大肠杆菌感受态细胞以及热激转化，质粒DNA的提取与纯化鉴定

4.1.5酶切片段的overlap区域的拼接

4.1.6 PCR方法连接文库中没有overlap的区域

4.1.7 PCR方法连接构建文库得到的四个分离片段

4.1.8噬菌体MZTP02c基因组序列生物信息学分析

4.2结果与分析

4.2.1噬菌体MZTP02c基因组对照酶切分析结果

4.2.2目标片段连接载体鉴定结果分析

4.2.3噬菌体基因组文库已知片段的拼接以及gapl和gapⅡ PCR扩增结果分析

4.2.4 PCR方法连接文库中四个分离片段的结果分析

4.2.5 MZTP02c基因文库计算机信息学分析

4.3讨论

4.4小结

第五章噬菌体MZTP02c保藏方法探索

5.1方法

5.1.1噬菌体在非冷冻状态下各种保存条件的比较

5.1.2噬菌体在冷冻条件下各种保存条件的比较

5.2结果与分析

5.2.1噬菌体在非冷冻状态各种保藏条件下的滴度变化

5.2.2噬菌体在冷冻状态各种保藏条件下的滴度变化

5.3讨论

5.4 小结

总 结

参考文献

致谢