PPARα介导的AMPK激活对心肌肥厚及能量代谢的调节作用

摘要

心肌肥厚是导致心力衰竭、心律失常和猝死主要原因之一。本课题针对心肌肥厚的产生机制：AMPK/PPARα/能量代谢这一通路对心肌肥厚的影响提出。本课题对寻找新的治疗心肌肥厚及心衰的靶点有重要意义。实验分体内、体外实验和AMPK调控PPARα机制三大部分，是以原有研究激活单磷酸腺昔激活的蛋白激酶(AMPK)可抑制心肌肥厚为研究基础，通过主动脉缩窄诱导大鼠心肌肥厚及苯肾上腺素(PE)诱导原代培养的心肌细胞肥大，观察5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(AICAR)激活AMPK后心肌细胞过氧化物增殖物受体α(PPARα)表达、心肌能量代谢和肥大的变化以及siRNA技术阻断PPARα通路后，心肌能量代谢和肥大变化，以其阐明PPARα/能量代谢在AMPK激活抑制心肌肥厚中的作用。
　　 第一节AMPK激活对心肌肥厚的抑制作用
　　 为了探讨AMPK对压力负荷诱导的大鼠心肌肥厚影响，我们分别利用AMPK激活剂AICAR(0.5 mgAICAR/g body wt/d)干预主动脉缩窄(TAC)模型大鼠8周及PE诱导的培养肥大心肌细胞48小时。RT-PCR及[3H]亮氨酸掺入结果显示AICAR有抑制肥大相关基因ANP和β-MHC mRNA表达作用及[3H]亮氨酸掺入作用(p＜0.05或0.01)。而AMPK抑制剂Compound C则促进培养心肌细胞肥大相关基因ANP和β-MHC mRNA表达及[3H]亮氨酸掺入。心脏超声显示AICAR有改善压力负荷诱导的大鼠肥厚心脏心功能作用。小结：AMPK激活可抑制心肌肥厚，改善心功能。
　　 第二节PPARα在AMPK激活抑制心肌肥厚中的作用
　　 为了探讨PPARα是否参与AMPK调节心肌肥厚作用，我们通过RT-PCR和Western blot探讨AICAR对压力负荷诱导大鼠肥厚心肌PPARα mRNA和蛋白表达影响。结果显示与假手术组比较TAC组PPARα蛋白和mRNA表达明显下调(p＜0.01)。AICAR可以逆转TAC对PPARα的下调作用。体外研究也表明AICAR有抑制PE诱导的肥大心肌细胞PPARα下调作用，而AMPK抑制剂Compound C则促进PPARα下调。荧光酶分析也显示AICAR有增加PPARα转录活性作用，而Compound C则抑制PPARα转录活性。小结：AMPK激活通过激活PPARα信号抑制心肌肥厚。
　　 第三节PPARα-siRNA对AMPK抑制心肌细胞肥大的影响
　　 为进一步证实PPARα参与AMPK抑制心肌细胞肥大作用。我们检测siRNA沉默PPARα后，AICAR对[3H]-亮氨酸掺入的影响。PPARα-siRNA抑制效率大约70％，PPARα被抑制后AICAR抑制PE诱导的[3H]-亮氨酸掺入受阻。该结果进一步支持AMPK激活抑制心肌肥厚通过PPARα信号通路。
　　 第四节AMPK对肥厚心肌脂肪酸代谢的作用
　　 为了解AMPK对肥厚心肌脂肪酸代谢的调节作用，我们对大鼠离体心脏进行[14C]-棕榈酸灌注探讨肥大心脏对脂肪酸氧化影响。结果发现TAC组与假手术组比较脂肪酸氧化能力下降，AICAR+TAC组脂肪酸氧化增加，高于TAC组。我们的体外研究结果也显示PE诱导的肥大心肌细胞脂肪酸氧化下降，细胞内脂肪酸沉积增加，AICAR促进脂肪酸氧化并减少细胞内脂肪酸沉积。AICAR的这些作用在PPARα被小干扰抑制后受阻。结果表明激活AMPK可通过PPARα激活促进心肌细胞利用脂肪酸，减少脂肪酸在细胞内沉积。小结：肥厚心肌脂肪酸氧化能力下降，AICAR抑制心肌肥厚同时改善脂肪酸代谢。
　　 第五节AMPK对肥厚心肌葡萄糖代谢的作用
　　 为了解AMPK对肥大心肌葡萄糖酸代谢的调节作用，我们对大鼠离体心脏进行[14C]-葡萄糖灌注探讨肥大心脏对葡萄糖代谢影响。结果发现TAC组与对照组比较葡萄糖摄取及氧化明显增多(p＜0.01)，AICAR促进葡萄糖摄取但抑制葡萄糖氧化(p＜0.05)。我们的体外研究结果显示PE诱导的肥大细胞葡萄糖利用增加，AICAR促进葡萄糖摄取，但不影响肥大心肌细胞对葡萄糖的氧化利用。转染PPARα-siRNA抑制PPARα表达后，不影响AMPK对心肌细胞葡萄糖利用。结果表明激活AMPK可促进葡萄糖利用，但激活AMPK调节心肌葡萄糖代谢与PPARα无关。小结：激活AMPK抑制心肌肥厚可能与其逆转能量代谢转换有关，AMPK逆转肥大心肌细胞能量代谢转换主要通过调节脂肪酸实现。
　　 第六节AMPK调控PPARα机制
　　 AMPK激活抑制心肌肥厚通过再激活PPARα机制，但是AMPK调节PPARα的机制不清楚。通过对压力负荷诱导心肌肥厚分析我们发现，AICAR抑制心肌肥厚同时伴有磷酸化的P38表达增高，磷酸化ERK1/2表达下降。由此推测AMPK激活可能与磷酸化的P38和磷酸化ERK1/2信号有关。通过体外细胞培养研究，Western blot结果显示磷酸化的P38在PE干预组与AICAR干预组比较没有明显差别(p＞0.05)，而AICAR干预明显抑制磷酸化ERK1/2表达，AMPK抑制剂Compound C干预增加磷酸化ERK1/2表达。磷酸化ERK1/2表达与PPARα相平行。小结：AMPK是通过ERK1/2信号调控PPARα的。
　　 结论：
　　 1、激活AMPK有抑制心肌肥厚作用。
　　 2、AMPK激活通过激活PPARα信号通路抑制心肌肥厚。
　　 3、AMPK激活抑制心肌肥厚与纠正能量代谢有关。
　　 4、AMPK通过PPARα信号通路调节心肌能量代谢。
　　 5、AMPK是通过ERK1/2信号调控PPARα的表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

前言

第一节AMPK激活对心肌肥厚的抑制作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第二节PPARa在AMPK激活抑制心肌肥厚中的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第三节PPARα-siRNA对AMPK抑制心肌细胞肥大的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

第四节AMPK对肥厚心肌脂肪酸代谢的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第五节AMPK对肥厚心肌葡萄糖代谢的作用

1材料与方法

2结果

3讨论

第六节AMPK调控PPARα机制

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

创新之处

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