骨肉瘤细胞失巢凋亡的研究及VPA诱导MG63失巢凋亡的研究

摘要

第一章、骨肉瘤细胞失巢凋亡的研究。
　　 目的：用永生化成骨细胞hFOB1.19为阴性对照，比较MG63、U2OS、Saos2三种骨肉瘤细胞抗失巢凋亡生物学特性，探讨骨肉瘤抗失巢凋亡能力及机制。
　　 方法：利用poly-HEMA处理培养皿，模拟失巢环境，悬浮培养成骨细胞hFOB1.19和三种骨肉瘤细胞系MG63、U2OS、Saos2。利用光学显微镜分别对粘附培养和悬浮培养细胞显微结构进行观察；流式细胞仪检测在不同处理、不同时间下各种细胞的凋亡率和细胞周期。Western blot检测细胞Flip S/L蛋白、Caspase3蛋白表达。
　　 按照文献[23]方法培养骨肉瘤细胞系U2OS抗失巢凋亡子代细胞，研究子代和亲代U2OS细胞抗失巢凋亡差异以及Akt表达的不同，初步探讨发生的机制。
　　 结果：成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG63、Saos2、U2OS在悬浮培养下形态与贴壁生长的细胞相比都发生明显变化。镜下，未处理培养皿中hFOB1.19贴壁生长，细胞伸展呈多角型，三种骨肉瘤细胞生长良好，增殖迅速。hFOB1.19悬浮生长后，细胞呈小圆形单个细胞，聚集成团的细胞很少见，随着时间变化，细胞无明显增殖且出现凋亡。悬浮生长骨肉瘤细胞变圆，聚集成团，单个骨肉瘤细胞较少见，随着时间推移，部分细胞发生凋亡坏死形态学改变。
　　 PI单染流式细胞仪检测显示，永生化的成骨细胞hFOB1.19在失巢悬浮环境下出现明显凋亡，72h凋亡率为(85.95±2.12)％，与贴壁生长的对照组相比差别有统计学意义(P＜0.05)。三种骨肉瘤细胞系在失巢悬浮环境下都表现抗失巢凋亡特性，三种骨肉瘤细胞系失巢悬浮培养72h后，流式细胞仪检测凋亡率，结果显示，MG63凋亡率为(24.61±0.10)％、U2OS凋亡率为(47.54±7.08)％、Saos2凋亡率为(53.35±0.42)％，与失巢悬浮培养72h的hFOB1.19相比，差别有统计学意义(F=139.2，P＜0.05)。
　　 细胞失巢悬浮培养24h、48h和72h，Western blot检测Flip蛋白，结果显示hFOB1.19的Flip蛋白低表达，骨肉瘤细胞U2OS和MG63的Flip蛋白高表达，说明骨肉瘤细胞抗失巢凋亡和Flip高表达有关。
　　 进一步实验显示，经诱导抗失巢凋亡U2OS子代和亲代细胞，悬浮失巢培养72h，凋亡率分别为(34.12±5.50)％和(47.54±7.08)％，(p＜0.05)差别有统计学意义，说明子代细胞抗失巢凋亡能力增强。Western blot显示U2OS亲代和子代细胞随着凋亡增加，Akt表达逐渐降低，但子代细胞Akt表达明显高于亲代。提示U2OS子代抗失巢凋亡的增强与Akt高表达有关。
　　 结论：
　　 1.骨肉瘤细胞相对于正常成骨细胞具有抗失巢凋亡特性。
　　 2.骨肉瘤细胞抗失巢凋亡与细胞高表达Flip相关。
　　 3.骨肉瘤细胞抗失巢凋亡经诱导可进一步增强。
　　 4.子代骨肉瘤细胞的抗失巢凋亡能力增强与Akt高表达有关。
　　 第二章、VPA诱导骨肉瘤细胞MG63失巢凋亡的研究。
　　 目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)对骨肉瘤细胞系MG63抗失巢凋亡影响，探讨其发生机制。
　　 方法：不同浓度VPA处理MG63细胞24小时、48小时、72小时，MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期；Hoechst33258观察细胞凋亡核形态；软琼脂克隆形成实验检测VPA对MG63锚着不粘附增殖能力影响；Western blot检测蛋白Caspase3和蛋白Flip表达。
　　 结果：VPA处理骨肉瘤细胞系MG63后，肿瘤细胞发生明显增殖抑制，浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、16mmol/L的VPA处理MG63细胞48h，各浓度组的细胞增殖抑制率分别为0,(2.881±2.32)％， (6.0078±4.3)％， (8.9276±1.53)％，(41±4.15)％， (67.1085±0.98)％和(87.0775±1.23)％，和对照组相比，差别有统计学意义(P＜0.05)，说明VPA对MG63增殖抑制呈浓度依赖性。浓度为4mmol/L的VPA处理MG63细胞24h、48h和72h，各时间点的细胞增殖抑制率分别为(15.5469±6.52)％，(41±4.15)％，(72.8644±4.52)％，和对照组相比，差别有统计学意义(P＜0.05)，说明VPA对MG63增殖抑制呈时间依赖性。
　　 浓度为0，0.5，1，2，4，8mmol/L的VPA处理MG63细胞48h，流式细胞仪检测凋亡，结果显示，凋亡率分别为1.72％、10.02％，18.94％，21.78％，39.65％和32.05％，说明VPA能诱导MG63凋亡，且呈浓度依赖性。浓度为0，0.5，1，2，4，8mmol/L的VPA处理MG63细胞48h，细胞周期显示，G2期逐渐降低，由对照组13.9％降到8mmol/L的0.3％，S期由对照组34.7％上升到72.9％，差异有统计学意义(X2=65.828，p＜0.05)，说明VPA作用MG63，细胞周期阻滞在DNA合成期(S期)。
　　 Hoechst33258荧光染色显示不同浓度VPA处理MG63细胞48h后，对照组骨肉瘤细胞核形态呈现均匀淡蓝色圆形，随着VPA浓度加大，细胞核逐渐出现固缩，荧光加深，形态变得不规则。到高浓度8 mmol/L时，出现细胞碎裂，部分细胞坏死不显影。
　　 软琼脂克隆形成实验显示对照组的SMC细胞在锚定不粘附环境下不能增殖，仍呈单个细胞；未经VPA处理骨肉瘤细胞MG63在软琼脂内生长增殖迅速，72h内迅速形成(20±6)大克隆团，随VPA浓度加大，MG63在软琼脂内形成克隆能力明显减弱，2mmol/L集落数为(17±4)个，4mmol/L时为(8±5)个集落，高浓度8mmol/L的VPA处理的MG63细胞在软琼脂内不能形成集落，和对照组SMC细胞和未处理细胞MG63比较，差别有统计学意义(p＜0.05)，说明VPA抑制MG63锚定不粘附生长，促进其失巢凋亡。
　　 Western blot显示不同浓度VPA处理骨肉瘤后细胞出现凋亡，pro-Caspase3蛋白下调，随着凋亡增加，FlipS/L蛋白表达受抑制，说明VPA诱导凋亡与Flip抑制相关。
　　 结论：
　　 1.组蛋白去乙酰化抑制剂VPA可促进骨肉瘤细胞系MG63凋亡，且呈浓度和时间依赖性。
　　 2.VPA能够抑制MG63锚定不粘附生长，且呈浓度依赖性，提示VPA促进骨肉瘤MG63失巢凋亡。
　　 3.VPA可能通过抑制FlipS/L蛋白表达来促进骨肉瘤失巢凋亡。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章骨肉瘤细胞失巢凋亡研究

材料与方法

结 果

讨论

结论

第二章VPA诱导MG63失巢凋亡的研究

材料和方法

结 果

讨论

结 论

总结与展望

参考文献

附件

致谢