组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统在胚胎干细胞和神经干细胞分化研究中的应用

摘要

胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团(Inner cell mass，ICM)或桑椹胚，是一大类未分化的二倍体多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能[1]，是当前生命科学研究的热点，在发育生物学、遗传学、毒理学和药物筛选及新药开发等研究领域中发挥着日益重要的作用[2]。
　　 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多潜能细胞。研究表明，NSCs广泛存在于发育期和成年哺乳动物的中枢神经系统(CNS)中。在对人胚胎期NSCs的研究中，已先后从大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、侧脑室、室管膜下层、小脑和脊髓等区域分离出NSCs[3]。
　　 荧光蛋白报告基因作为分子标签，具有易于检测，灵敏度高；荧光性质稳定；构建载体方便；可直接用于活细胞测定等诸多优点，因此在分析生物技术和细胞内分子示踪方面得到广泛应用，如细菌和病毒学的研究、利用转基因动物进行基因表达的研究、免疫细胞的迁移、细胞凋亡、蛋白质间相互作用、癌症以及药物筛选等。近年研究表明，荧光蛋白标记在干细胞的移植、分离纯化、示踪、定量分析及分化状态的检测等方面也具有良好的应用前景。
　　 利用组织细胞特异启动子构建荧光蛋白报告基因载体转染干细胞，报告基因的表达需要特异启动子的激活，通过观察报告基因的表达可以动态追踪干细胞分化过程中相关基因的表达情况，不仅有助于筛选能诱导干细胞体外特异分化的小分子化合物以及具有发育毒性的药物，而且可以纯化特定的组织细胞。
　　 有鉴于此，本实验的主要研究思路，是采用外胚层组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统pLV/Final-puro-Tα1-α-tubulin-hrGFP和pLV/Final-neo-GFAP-dTomato转导人胚胎干细胞和小鼠神经干细胞，对转导后的细胞进行诱导分化，对所得到的荧光细胞进行鉴定和分析；因此，本研究主要分为以下二个部分：
　　 第一部分：组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统转导人胚胎干细胞及其诱导分化的实验研究。
　　 第二部分：组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统转导小鼠神经干细胞及其诱导分化的实验研究。
　　 第一部分组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统转导人胚胎干细胞及其诱导分化的实验研究
　　 1.1目的：
　　 首先通过对分子标记的检测和体内外分化实验及核型鉴定证明由本实验室建系的hES细胞株SYSU-10具有自我更新和多向分化潜能。选取外胚层组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统pLV/Final-puro-Tα1-α-tubulin-hrGFP、pLV/Final-neo-GFAP-dTomato(由本实验室构建)分别转导hES细胞，并使用puromycin、G418分别筛选后获得携带外源基因的纯化的hES细胞，然后加入诱导试剂促进hES细胞向神经元、星型胶质细胞分化，以获得表达Tα1-α-tubulin、GFAP的绿色或红色荧光细胞，并进行相关的鉴定分析。
　　 1.2方法：
　　 1.2.1SYSU-10细胞生物学特性的分析：对SYSU-10细胞的分子标记及体内外分化能力和核型进行检测。
　　 1.2.2通过分次转导的方法将组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统导入hES细胞。转导后第7天开始使用1-5μg/ml puromycin、300μg/ml G418筛选14天以获得带有表达载体的纯化的hES细胞。
　　 1.2.3加入各种诱导试剂促进hES细胞向神经元、星型胶质细胞分化，以获得表达Tα1-α-tubulin、GFAP的绿色或红色荧光细胞，并进行免疫组化和功能染色等的相关鉴定分析。
　　 1.3结果：
　　 1.3.1SYSU-10细胞碱性磷酸酶染色为强阳性，镜下见克隆中细胞密集区出现紫黑色颗粒，作为对照的饲养层细胞不能被染色。SYSU-10细胞免疫荧光细胞化学检测结果显示SYSU-10细胞的OCT-4、SSEA-4及TRA-1-60表达强阳性。SYSU-10细胞自然分化过程中，可见表达Albumin的内胚层细胞，表达Nestin的外胚层细胞，表达Desmin的中胚层细胞。体内分化实验，将裸鼠处死并取出肿瘤(均具有完整包膜)，进行石蜡切片和HE染色，可见三个胚层来源的细胞类型。SYSU-10细胞核型正常，为46，XX。
　　 1.3.2慢病毒转导7天后，加入1-5μg/ml puromycin、300μg/ml G418开始筛选，可以观察到有大量细胞死亡。筛选两周后，可以得到具有抗性的携带载体系统的纯化的hES细胞。
　　 1.3.3加入各种诱导试剂促进hES细胞向神经元、星型胶质细胞分化，获得了表达Tα1-α-tubulin的绿色荧光细胞，通过相关鉴定分析来源于转导Tα1-α-tubulinhESC的荧光细胞为神经元。
　　 1.4结论：
　　 1.4.1SYSU-10细胞生物学特性：SYSU-10细胞表达Oct4、SSEA-4、TRA-1-60，在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。核型正常，为46，XX。
　　 1.4.2成功利用组织特异启动子携带荧光报告基因的慢病毒载体转导hES细胞，转导后的hES细胞经过筛选获得纯化的细胞群，细胞生长和分化能力不受病毒转导的影响。
　　 1.4.3成功诱导携带含组织特异启动子及荧光报告基因的慢病毒载体的hES细胞分化为表达绿色荧光的特定细胞类型，为以后分化机理和移植治疗的研究提供了很好的工具。
　　 第二部分组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统转导小鼠神经干细胞及其诱导分化的实验研究
　　 2.1目的：
　　 选取外胚层组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统pLV/Final-puro-Tα1-α-tubulin-hrGFP、pLV/Final-neo-GFAP-dTomato分别转导小鼠神经干细胞(NSCs)并进行纯化，然后加入诱导试剂促进NSCs向神经元、星型胶质细胞分化，以获得表达Tα1-α-tubulin、GFAP的绿色或红色荧光细胞，并进行相关的鉴定分析。
　　 2.2方法：
　　 2.2.1通过分次转导的方法分别将两种慢病毒载体导入NSCs。转导后第7天开始使用1-5μg/mlpuromycin、300μg/mlG418筛选7天，以获得带有不同表达载体系统的纯化的NSCs。
　　 2.2.2加入各种诱导试剂促进NSCs向神经元、星型胶质细胞分化，以获得表达Tα1-α-tubulin、GFAP的绿色或红色荧光细胞，并进行免疫组化染色等相关鉴定分析。
　　 2.3结果：
　　 2.3.1慢病毒转导7天后，加入puromycin、G418开始筛选，可以观察到有一定量细胞死亡。筛选7天后，可以得到抗puromycin、G418的携带载体系统的纯化的NSCs。
　　 2.3.2加入各种诱导试剂促进NSCs向神经元、星型胶质细胞分化，获得了表达Tα1-α-tubulin和GFAP的红色或绿色荧光细胞，通过相关鉴定分析证实来源于转导Tα1-α-tubulin和GFAP的荧光细胞为早期神经元和星型胶质细胞。
　　 2.4结论：
　　 2.4.1成功利用慢病毒转导NSCs,经过筛选获得的细胞群，可以分化为神经元和星型胶质细胞。
　　 2.4.2成功诱导携带不同外源基因的NSCs分化为表达红色或绿色荧光的特定细胞类型，为以后分化机理和移植治疗的研究提供了很好的工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词汇表

声明

引言

第一部分 组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统转导人胚胎干细胞及其诱导分化的实验研究

目的

材料

方法

结果

讨论

小结

第二部分 组织特异启动子携带荧光报告基因的载体系统转导小鼠神经干细胞及其诱导分化的实验研究

目的

材料

方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

附录 发表论文情况如下

致谢