卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶活性和端粒长度的检测及意义

摘要

本研究通过对人卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶活性和端粒长度与卵子成熟、受精、卵裂、胚胎质量以及IVF临床结局关系的研究，探讨是否可将颗粒细胞端粒酶活性及端粒长度作为临床评估卵子成熟、胚胎发育和IVF治疗结局的客观指标，为个体化选择治疗方案、提高妊娠率提供理论基础和实验依据。
　　 第一章、端粒酶活性在卵巢黄素化颗粒细胞中的表达及意义
　　 对象与方法
　　 1.研究对象的选择及临床操作流程
　　 1.1研究对象的选择选择2009年9月～2009年11月在中山大学附属第二医院生殖中心接受新鲜周期IVF/ICSI助孕治疗的不孕患者共56例。
　　 纳入标准(同时满足以下4点者纳入)：(1)育龄期女性(年龄20～45岁)；(2)月经周期规则，具有正常排卵功能，血清基础卵泡刺激素(Basal folliclestimulating hormone，B-FSH)＜8.78IU/L，B-LH＜9.50IU/L；(3)输卵管因素(经子宫输卵管碘油造影(Hysterosalpingogram，HSG)或腹腔镜检查证实的输卵管梗阻或输卵管切除术后)、盆腔因素和/或男性因素所致不孕；(4)控制性超排卵方案选择黄体中、晚期长方案。
　　 排除标准(凡满足以下5点中任何一点者均排除)：(1)IVF不受精行补救ICSI者；(2)排卵障碍性疾病(如多囊卵巢综合征、高泌乳素血症等)及内分泌疾病；(3)子宫内膜异位症、子宫腺肌症和粘膜下子宫肌瘤；(4)治疗前三个月使用免疫调节、细胞因子及有细胞毒性等药物；(5)有卵巢手术史及严重器质性疾病史。
　　 1.2临床操作流程入组患者行黄体中、晚期长方案促性腺激素释放激素激动剂(gon-adotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a)长方案超排卵。治疗过程中根据患者的卵巢反应性调整促排卵药物的剂量和使用时间，有3个卵泡直径≥16 mm或2个卵泡直径≥17mm或1个卵泡直径≥18mm时，当晚注射HCG并在34～36 h后经阴道B超引导穿刺取卵。按常规IVF/ICSI方法授精和胚胎培养，d3或d5天在腹部B超引导下移植胚胎，剩余的可利用胚胎冷冻保存。移植后用黄体酮或HCG支持黄体功能，2周后行尿妊娠试验或血β-HCG、P检测。5周后B超检测到宫内孕囊者确定为临床妊娠。
　　 2.方法
　　 取卵术毕待卵泡液内卵-冠-丘复合物捡出后，分别收集每例患者剩余的卵泡液。密度梯度离心法提纯颗粒细胞，裂解细胞提取总蛋白并用BCA法测定蛋白含量，采用端粒重复序列扩增程序(telomere repeat amplification protocol，TRAP)及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)银染法检测端粒酶活性。PAGE凝胶上出现间隔6bp的梯形条带为端粒酶活性阳性，反之为阴性。Quantity One4.6.2软件半定量法分析阳性泳道的条带。曲线下面积的平均光密度值≤0.65OD×mm为端粒酶活性弱阳性(+)，(0.65,1.00]OD×mm为端粒酶活性中等表达(++)，＞1.00OD×mm为端粒酶活性高表达(+++)。
　　 结果：
　　 研究对象的平均年龄为(30.54±0.56)岁，体重指数(Body mass index，BMI)为(21.20±0.36)kg/m2，B-FSH为(6.72±0.18)IU/L、B-LH为3.86IU/L、B-FSH/LH为(1.92±0.12)。
　　 1.卵巢黄素化颗粒细胞端粒酶活性的表达
　　 (1)56份黄素化颗粒细胞标本中，39份有端粒酶活性(约占69.64％)，17份无端粒酶活性(约占30.36％)。按端粒酶活性将研究对象分为四组：(-)组(0OD×mm，n=17例)、(+)组(0.53OD×mm，n=16例)、(++)组(0.86±0.03OD×mm，n=14例)和(+++)组(1.26±0.04 OD×mm，n=9例)。
　　 (2)端粒酶活性(++)和(+++)患者的月经期第1～5天血清睾酮(Testerone，T)水平明显高于端粒酶活性(-)者(分别为(1.43±0.10)vs(1.08±0.11)noml/L，P＜0.030；(1.56±0.08)vs(1.08±0.11)noml/L，P＜0.005)。Spearman关联性分析发现端粒酶活性与T呈正相关(r=0.291，P＜0.011)。余各组患者的年龄、BMI、卵巢储备功能(B-FSH、B-LH、B-FSH/LH、B-E2和双侧卵巢窦卵泡数)及控制性超排卵治疗(Gn总用量、Gn使用天数和HCG日E2水平)均无明显差异(P＞0.05)。
　　 2.卵子及胚胎质量
　　 四组患者的成熟卵数(分别为：(-)组(10.05±0.86)个vs(+)组(11.95±0.91)个vs(++)组(12.48±1.18)个vs(+++)组(10.88±1.19)个)、成熟卵率(分别为：(-)组(85.45±2.77)％vs(+)组88.89％vs(++)组93.65％vs(+++)组(80.42±5.02)％)、优质胚胎数(分别为：(-)组(1.00±0.37)个vs(+)组(1.63±0.59)个vs(++)组(1.71±0.44)个vs(+++)组(1.56±0.69)个)和优质胚胎率(分别为：(-)组7.18％vs(+)组14.84％vs(++)组(15.78±3.69)％vs(+++)组(16.53±6.28)％)，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；Spearman关联性分析未发现端粒酶活性与成熟卵数(率)或优质胚胎数(率)的相关性(P＞0.05)。
　　 获卵数、MⅡ期卵数、受精率及卵裂率、可利用胚胎率、囊胚移植率和移植优质胚胎数均无明显差异(P＞0.05)。
　　 3.临床结局
　　 胚胎种植率及临床妊娠率均随黄素化颗粒细胞端粒酶活性的增加而逐渐升高，各组早期流产率无显著差异(P＞0.05)。
　　 (1)胚胎种植率分别为：(-)组18.92％、(+)组25.71％、(++)组48％和(+++)组52.63％，组间差异有统计学意义(P＜0.018)。其中，(++)组和(+++)组患者的胚胎种植率明显高于(-)组(P分别＜0.015和0.009)。在排除年龄、HCG日E2/P、移植囊胚数和移植优质胚胎数等对胚胎种植的影响后发现：(+++)组患者发生胚胎种植的优势是(-)组的8.290倍(95％CI：1.049～65.516，P＜0.045)。
　　 (2)临床妊娠率分别为：(-)组29.41％、(+)组37.50％、(++)组50％和(+++)组77.78％，组间差异无统计学意义(P＞0.05)。排除年龄、BMI、B-FSH/B-LH比值、T、Gn总量、HCG日E2值、获卵数、优质胚胎数、移植优质胚胎数和移植囊胚数等因素对妊娠的影响后发现：(+++)组患者妊娠的优势分别为(-)组的9.692倍(95％CI：1.363-68.941，P＜0.023)、(+)组的14.886倍(95％CI：1.975-112.222，P＜0.009)和(+++)组的5.596倍(95％CI：0.712-43.970，P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.大多数接受控制性超排卵患者的卵巢黄素化颗粒细胞中可以检测到端粒酶活性，提示颗粒细胞具有一定增殖潜能。
　　 2.卵巢黄素化颗粒细胞的端粒酶活性能在一定程度上反映卵子和胚胎质量，对预测体外授精治疗的临床结局有参考价值。
　　 第二章、卵巢黄素化颗粒细胞端粒长度的检测及意义
　　 研究对象与方法：
　　 1.研究对象的选择及临床操作流程
　　 1.1研究对象的选择选择2009年5月～2009年8月在中山大学附属第二医院生殖中心接受新鲜周期IVF/ICSI助孕治疗的不孕患者37例进行研究，纳入与排除标准同第一章。
　　 1.2临床操作流程所有入组患者均采用与第一章相同的黄体中、晚期GnRH-a长方案行控制性超排卵、取卵、胚胎培养和移植。
　　 1.3实验分组首先根据黄素化颗粒细胞的端粒长度(T表示端粒基因，S表示内参基因36B4，端粒与36B4的比值即该DNA的端粒长度，再与参照DNA的端粒长度相比得出该DNA的相对端粒长度，即相对T/S比值)将研究对象分为两组：相对T/S＜1.00(A组，n=19)和T/S≥1.00(B组，n=18)；其次，由于女性在35岁之后生育力明显下降[13-14]，因此再以该年龄段分为：Ⅰ组(低龄：20～34岁，n=26)、Ⅱ组(高龄：35～45岁，n=11)。可依次组合成4种水平：ⅠA(低龄短端粒，n=13)、Ⅰ B(低龄长端粒，n=6)、ⅡA(高龄短端粒，n=13)和ⅡB(高龄长端粒，n=5)。
　　 2.方法
　　 取卵术毕待卵泡液内卵-冠-丘复合物捡出后，分别收集每例患者剩余的卵泡液。密度梯度离心法提纯颗粒细胞，提取细胞基因组DNA并测定核酸含量，采用荧光实时定量多聚酶链反应(Real-time Polymerase Chain Reaction，Real-timePCR)检测端粒长度。
　　 结论：
　　 1.黄素化颗粒细胞的端粒长度与卵泡发育有关，能在一定程度上反映胚胎质量。
　　 2.黄素化颗粒细胞的端粒长度对IVF/ICSI治疗结局的预测不如端粒酶活性敏感，在实际的临床操作中端粒酶活性可能比端粒长度更有应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词

声明

前言

第一章端粒酶活性在卵巢黄素化颗粒细胞中的表达及意义

研究对象与方法

结果

讨论

结论

第二章卵巢黄素化颗粒细胞端粒长度的检测及其意义

研究对象与方法

结果

讨论

结论

全文结论

参考文献

本研究的局限性和展望

附图

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