马兜铃酸Ⅰ对NRK-52E上皮细胞紧密连接和粘附连接影响的研究

摘要

马兜铃酸(Aristolochic acid，AA)为硝基菲类化合物，根据其甲氧基的位置不同可分为AAⅠ、AAⅡ、AAⅢ和AAⅣ。最常见的含马兜铃酸的中草药包括关木通、广防己、青木香、马兜铃、细辛和寻骨风等。各种AA类化合物中，AAⅠ的细胞毒性最强。1993年比利时首先报道了由于服用含马兜铃酸的减肥丸导致严重肾间质纤维化的病例。此后世界各地陆续报道了这种由于服用含马兜铃酸中草药引起的间质性肾脏疾病，并命名为“马兜铃酸肾病(Aristolochic acidnephropathy，AAN)。最近的研究发现，流行于巴尔干地区的地方病“巴尔干肾病”可能与误食被马兜铃酸污染的面粉有关。马兜铃酸肾病以严重的肾间质纤维化和小管上皮细胞萎缩、脱落、再生障碍为特征。研究表明，肾间质成纤维细胞以及浸润的单核细胞在问质纤维化中起重要作用，其中部分成纤维细胞来源于转分化的小管上皮细胞。然而马兜铃酸引起肾间质纤维化的机制仍不甚清楚。
　　 上皮细胞紧密连接(Tight Junction，TJ)是上皮细胞连接复合体的一部分，由若干特殊的蛋白组成，其中包括跨膜蛋白occludin、JAM、claudins以及膜周蛋白zonula occludens(ZO-1、ZO-2、ZO-3)。TJ控制着细胞旁通路的物质转运，并通过阻止细胞脂质和蛋白在细胞膜各部分间的移动而维持上皮细胞极性。此外TJ还与细胞分化、增殖以及上皮细胞转分化(Epithelial mesenchymaltransdifferentiation，EMT)有关。紧密连接的改变可影响肾小管上皮细胞屏障功能，并影响机体内环境的稳态。有研究提示，转化生长因子-β1(Transforminggrowth factor,TGF-β1)引起的EMT与ZO-1、E-cadherin的改变相关。目前关于马兜铃酸对细胞紧密连接结构及其功能的影响尚未见报道。
　　 一、研究目的
　　 探讨AAI对培养的NRK-52E细胞紧密连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Par3表达和分布以及细胞连接功能的影响。
　　 二、方法
　　 用不同浓度AAI(0、5、10、25、50和100μM)作用NRK-52E细胞4h；或用AAI(25μM)作用NRK-52E细胞0、4、8、12、16和24h。用MTT法检测细胞活性，用流式细胞仪检测细胞凋亡。用western blot法检测细胞连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Par3的表达，用免疫荧光法检测上述三种蛋白的细胞分布，同时检测跨上皮细胞电阻抗以确定细胞通透性。
　　 三、结果
　　 (一)AAI对细胞活力及凋亡的影响
　　 用上述不同浓度AAI作用4h，细胞活性无明显改变；用AAI(25μM)作用细胞12、16和24h，与0h比较，细胞活性分别下降至78.8+7.4％，77.5±14.8％和72.3±11.7％(P＜0.01)。用上述不同浓度AAI作用细胞4h，细胞早期凋亡率和晚期凋亡率与对照组比较无显著差别；AAI(25μM)作用细胞24h，细胞早期凋亡率为4.97±0.35％，晚期凋亡率达11.07±1.11％，与0h相比有显著差别(P＜0.01)。
　　 (二)AAI对连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Par3表达的影响：
　　 用5、10、25、50和100μM AAI作用细胞4h，ZO-1表达分别为对照组73.6±16.9％(P＜0.01)、64.1±9.2％(P＜0.01)、58.4±12.6％(P＜0.01)、54.9±11.0％(P＜0.01)和36.0±6.3％(P＜0.01)；E-cadherin分别为对照组的80.7±10.7％(P＞0.05)、72.5±21.7％(P＜0.05)、66.3±17.4％(P＜0.01)、47.9±6.8％(P＜0.01)和26.1±0.4％(P＜0.01)；Par3分别为对照组的61.7±3.3％(P＜0.01)、47.9±8.6％(P＜0.01)、45.2±7.0％(P＜0.01)、41.1±3.7％(P＜0.01)和35.1±6.2％(P＜0.01)。
　　 用AAI(25μM)作用细胞2、4、8、12、16 h，ZO-1表达分别为对照组的93.2+1.2％(P＞0.05)、63.5±5.3％(P＜0.05)、57.3±7.9％(P＜0.01)，52.4±4.2％(P＜0.01)和35±1.2％(P＜0.01)；E-cadherin表达分别为对照组的85.8±4.4％(P＞0.05)、80.8±8.1％(P＜0.05)、64.2±10.2％(P＜0.01)、45.9+1.0％(P＜0.01)和38.5±10.4％(P＜0.01)；Par3表达分别为对照组的91.4±3.1％(P＞0.05)、67.5±1.8(P＜0.05)、69.4±2.2％(P＜0.05)、45.2±6.9％(P＜0.01)和31.2±0.1％(P＜0.01)。
　　 (三)AAI对连接蛋白ZO-1、E-cadherin、Par3表达和分布的影响：
　　 用25μM AAI作用细胞4h，免疫荧光显示细胞ZO-1、 E-cadherin、Par3荧光强度下降；用50μM和100μM AAI作用细胞4h，荧光强度下降，细胞膜上蛋白呈断裂分布。ZO-1、Par3从细胞膜上解聚的同时，胞浆内分布增多。
　　 用25μM AAI作用细胞4、8、12和16h，荧光强度逐渐下降，细胞膜上蛋白呈断裂分布，且ZO-1、Par3从细胞膜上解聚，胞浆内分布增多。随着时间延长，上述变化加重。
　　 (四)AAI对细胞连接蛋白功能的影响
　　 AAI引起NRK-52E跨上皮细胞电阻抗时间-浓度依赖性减低。用5、10、25、50和100μM AAI作用细胞4 h，TEER分别降至初始值的56.6±10.7％，47.0±3.6％，44.3±3.5％，37.6±4.0％和32.1±6.3％，P＜0.01)。用25μM AAI分别作用细胞0.5、1、2、4、6、8、12和24h，TEER降至初始值的76.1±4.5％、53.9±7.9％、50.9±8.4％、44.3±3.5％、34.6±9.1％、23.2±8.8％、9.8±13.9％和-2.0±4.9％(P＜0.01)。
　　 (五)AAI对细胞aPKC表达的影响
　　 免疫荧光结果显示，25μM AAI刺激细胞4h，细胞膜上aPKC表达较未刺激细胞减少。
　　 (六)AAI对细胞α-SMA表达的影响
　　 免疫荧光结果显示，未经处理的NRK-52E细胞不表达α-SMA；25μM AAI刺激细胞4h，α-SMA表达于细胞浆
　　 四、结论
　　 小剂量AAI短时间作用于肾小管上皮细胞，可导致细胞紧密连接蛋白表达降低及分布异常，细胞连接功能降低。马兜铃酸诱导细胞连接结构和功能的改变发生在细胞凋亡前，且伴随α-SMA表达。提示上皮细胞连接破坏可能是马兜铃酸启动肾小管上皮细胞损伤及转分化的重要环节。

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