石斑鱼虹彩病毒(SGIV)DNA疫苗的筛选及囊膜蛋白VP16的特征分析

摘要

近年来，高密度水产养殖业的快速发展带来了水环境污染的日益加剧，致使各种水产病害特别是病毒性疾病大规模爆发，给鱼类养殖造成了巨大的经济损失。新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)就是一种从养殖的石斑鱼中分离到的水产动物重要病毒病原。鱼类细胞培养是进行鱼类病毒分离繁殖，进而研究鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基础一步。而疫苗作为化学药品和抗生素的替代品，是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。本研究建立了赤点石斑鱼肝组织细胞系，同时根据SGIV全基因组序列信息，运用反向疫苗学分析方法，从大量的病毒编码基因中鉴定到了3个能产生明显保护作用的基因，同时对SGIV囊膜蛋白VP16的分子特征进行了分析。结果简述如下：
　　 1)赤点石斑鱼肝组织细胞系的建立与特征分析。细胞在温度25-30℃、含10％胎牛血清的MEM培养基中增殖良好。在25℃培养条件下，细胞生长速率随着血清浓度(5-20％)的升高而增加，最佳血清浓度为15-20％。染色体分析显示特征染色体数目为48条。本研究进一步分析了细胞对4种鱼类病毒的敏感性，结果显示仅有SGIV感染的细胞观察到了明显的细胞病变效应，免疫荧光和电镜观察进一步确认了细胞的SGIV敏感性。细胞转染pEGFP-N3质粒后观察到了明显的绿色荧光，说明此细胞系能够用于转基因和基因遗传操作。
　　 2)SGIV DNA疫苗候选基因的鉴定。运用反向疫苗学的分析方法，利用一系列生物信息学工具从SGIV全基因组序列中筛选到了13个疫苗候选基因，克隆到真核表达载体pcDNA3.1，免疫石斑鱼幼鱼，鉴定到了3个能产生明显保护作用的基因。
　　 3)SGIV VP16的克隆及分子特征分析。从SGIV全基因组中克隆了VP16编码基因全长，原核表达纯化并免疫小鼠制备了抗体。序列分析表明，VP16编码基因是蛙病毒属特有的基因。RT-PCR、Western-blot分析与药物抑制实验揭示该基因是一个晚期基因。免疫荧光观察结果表明，VP16在感染细胞中主要聚集在病毒加工厂。同时本研究比较了三种不同的表面活性剂(Triton X-100、NP-40和SDS)分离SGIV囊膜蛋白的效果。结果表明，0.1％SDS能完全溶解病毒囊膜而不破坏衣壳的完整性，达到分离囊膜的效果。利用上述方法，证明了VP16是病毒的外囊膜蛋白。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章文献综述

1.1虹彩病毒研究概况和鱼类细胞系的应用

1.2疫苗研究新策略——反向疫苗学研究进展综述

1.3本论文研究的目的、意义

1.4创新点

第二章赤点石斑鱼肝组织细胞系的建立及其生物学特性分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

第三章新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)DNA疫苗的筛选

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

第四章SGIV囊膜蛋白VP16的鉴定与特征分析

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.3小结

全文总结及今后工作展望

1.全文总结

2.今后工作展望

参考文献

附录

博士期间发表和待发表的文章

致谢