低桔霉素紫色红曲霉菌株的构建及其色素发酵条件的优化

摘要

红曲霉(Monascus)是我国重要的微生物资源，是生产红曲米、红曲红及其他功能性红曲的主要菌种，被广泛运用于现代工业中。但自从具有肾毒性的桔霉素被发现后，红曲产品的安全性引起了人们的关注，其应用范围也受到了一定的限制。因此，获得不产或低产桔霉素的红曲菌株，对于红曲工业的发展意义重大。
　　 本研究提供了一种构建低桔霉素红曲霉工程菌的方法。在生物信息学指导下，应用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)技术制备桔霉素合成酶相关基因pksCT的转录激活因子ctnR的无效等位基因片段，通过限制性内切酶介导(REMI)的方法转化红曲霉原生质体，借助同源重组方式置换ctnR基因，实现了对该转录激活因子的敲除。利用桔霉素对枯草芽孢杆菌的抑制特征对转化子进行初步筛选，并对获取的低产桔霉素菌株运用分子生物学方法(PCR)及高效液相色谱分析进行了验证。与出发菌株相比，转化子桔霉素产量降低了58％，而色素产量提高了30％。
　　 对获得的转化子进行了生物学特性分析，并采用添加酵母破碎的方法对其红曲色素的液态发酵生产进行了优化。通过在不同的时间往接种了红曲霉并开始培养的摇瓶中加入不同量的酵母破碎液，研究在酵母破碎液作用下，菌体生长及醇溶性及水溶性色素产量的变化，发现在500 mL的三角瓶装液150 mL情况下，接种红曲霉培养48 h后加入1.5 mL酵母破碎液(50 mL OD600咖为1.8的发酵液碎离心后菌体用15 mL缓冲液重悬、破碎、过滤所得)可以明显提高醇溶性及水溶性色素产量，增幅分别达到120％和190％。
　　 此外，分别对醇溶性及水溶性色素的稳定性进行了研究，发现红曲色素对光敏感，易受盐浓度的影响，但对热有一定的稳定性，受Fe2+、Fe3+、Cu2+以外的大部分金属离子影响较小，且上述因素中，醇溶性色素稳定性比水溶性色素稳定性好。pH对醇溶性和水溶性色素的影响不同，醇溶性色素在中性偏酸性环境稳定性较好，而水溶性色素在碱性偏中性较稳定。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词

声明

第1章绪论

1.1概述

1.2红曲霉的分类地位及生物学特性

1.2.1红曲霉的分类地位

1.2.2红曲霉的生物学特性

1.3红曲霉的代谢产物

1.3.1红曲色素

1.3.2 Monacolin K

1.3.3 γ-氨基丁酸

1.3.4麦角固醇

1.3.5红曲霉的其他代谢产物

1.4桔霉素与红曲产品的安全性

1.4.1红曲中桔霉素的发现

1.4.2桔霉素的理化性质

1.4.3桔霉素的毒理性质

1.4.4桔霉素在红曲霉内的合成途径

1.4.5桔霉素的检测方法

1.4.6控制红曲产品中桔霉素的方法

1.5基因敲除

1.6红曲产品的发展前景

l.7本研究的意义、目的及其研究内容

第2章红曲霉桔霉素合成相关基因的敲除

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1红曲霉基因组DNA制备

2.3.2替换基因片段的制备

2.3.3用于同源重组的基因片段(融合基因)的纯化

2.3.4原生质体制备及再生

2.3.5转化子初筛

2.3.6疑似转化子的替换序列验证

2.3.7转化子的桔霉素含量

2.3.8红曲红色素的含量测定

2.4讨论

2.5 小结

第3章转化子的形态特征及生理特性研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.3结果与分析

3.3.1转化子在不同平板上的的生长状况及菌落形态

3.3.2孢子温度耐受性

3.3.3孢子乙醇耐受性

3.3.4孢子pH耐受性

3.3.5温度对液态发酵红色素产量的影响

3.4讨论

3.5 小结

第4章酵母破碎液对红曲霉红色素生产能力的影响

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1酵母破碎液对红曲霉红色素生产的影响

4.3.2酵母破碎液加入时间对红曲霉红色素产量的影响

4.3.3酵母破碎液加入量对红曲霉红色素产量的影响

4.3.4酵母破碎液对红曲色素色调的影响

4.3.5酵母破碎液对红曲霉菌体生长的影响

4.4讨论

4.5结论

第5章红曲色素稳定性研究

5.1 前言

5.2材料与方法

5.2.1实验材料

5.2.2实验方法

5.3结果与分析

5.3.1光照对红曲色素稳定性的影响

5.3.2温度对红曲色素稳定性的影响

5.3.3金属离子对红曲色素稳定性的影响

5.3.4盐浓度对红曲色素稳定性的影响

5.3.5 pH对红曲色素稳定性的影响

5.4讨论

5.5 小结

参考文献

致谢